黄芪甲苷对高胰岛素诱导人肾小球系膜细胞损伤的保护作用及机制研究

李贵平，李维祖，段文婷，李卫平，2

黄芪甲苷对高胰岛素诱导人肾小球系膜细胞损伤的保护作用及机制研究

李贵平1，李维祖1，段文婷1，李卫平1，2

摘要目的研究黄芪甲苷（As-IV）对高胰岛素诱导人肾小球系膜细胞（HMCs）损伤的保护作用及其机制。方法以HMCs为研究对象，用MTT法检测不同浓度胰岛素作用不同时间后对HMCs增殖的影响，筛选胰岛素的量效与时效关系；实验设正常组、高胰岛素（64 nmol／L）组、二碘苯（DPI 10 μmol／L）组、抗氧化剂Tempol（100μmol／L）组、PI3K／Akt信号通路抑制剂LY294002（10μmol／L）组与黄芪甲苷（As-Ⅳ25、50、100μmol／L）组。培养48 h后，MTT法检测HMCs的细胞增殖状况，DCFH-DA法测定细胞内活性氧（ROS）含量，Western blot法检测NADPH氧化酶4（NOX4）、磷酸化蛋白激酶B（p-PKB）（又称p-Akt）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）蛋白表达的变化。结果随着浓度增加与作用时间延长，胰岛素对HMCs增殖有促进作用且有量效与时效关系；与高胰岛素组比较，DPI组、Tempol组、LY294002组与As-IV 25、50、100μmol／L组均能有效抑制高胰岛素诱导的细胞增殖，减少细胞内ROS含量，降低NOX4、p-Akt、pmTOR蛋白的高表达（P＜0．05，P＜0．01）。结论胰岛素呈时间和浓度依赖性促HMCs细胞增殖；As-IV对高胰岛素诱导的HMCs有保护作用，其作用机制可能与抑制HMCs的过度增殖，减少细胞内ROS生成，降低NOX4、p-Akt、p-mTOR蛋白高表达有关。

关键词高胰岛素；人肾小球系膜细胞；黄芪甲苷；活性氧；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化哺乳动物雷帕雷素靶蛋白

2015-06-25接收

2安庆医药高等专科学校，安庆246052

李卫平，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：lwp19＠126．com

高胰岛素血症（hyperinsulinism，HINS）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）的常见临床表现之一，既是1型糖尿病治疗中的常见现象，也是2型糖尿病的重要特征。糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）作为DM的常见并发症，其发病机制十分复杂。HINS能够促进DN的发生发展，加重肾损伤［1-3］。黄芪甲苷（astragalosides IV，As-IV）是从豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根中分离的一种单体化合物，是黄芪发挥药理作用的重要有效成分。研究［4-5］显示，黄芪甲苷有抑制细胞肥大、抗氧化、免疫调节等多种药理作用。该研究采用体外培养人肾小球系膜细胞（human mesangial cells，HMCs），根据文献［6-7］，设计观察1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L胰岛素对HMCs细胞增殖的影响，并模拟HINSDM患者体内的高胰岛素环境，观察高胰岛素对HMCs以及As-IV对高胰岛素处理的HMCs中NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）、磷酸化蛋白激酶B（phosphor-protein kinase b，p-PKB）（又称p-Akt）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphor-mammalian targetof rapamycin，p-mTOR）蛋白表达、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的影响，探讨HINS诱导DN发生发展及As-IV发挥保护作用的可能机制，从而为临床上 DN的防治及 As-IV的应用提供依据。

1　材料与方法

1．1材料HMCs株（中南大学现代分析测试中心细胞室）；As-IV纯度＞98%（南京泽朗医药科技有限公司）；牛胰岛素、四甲基偶氮唑盐（MTT）、二碘苯（DPI）、抗氧化剂Tempol、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；PI3K／Akt信号通路抑制剂LY294002（Abmole中国公司）；DMEM低糖培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青科技有限公司）；二氢二氯荧光素（2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；β-actin（北京中杉金桥生物技术有限公司）；NOX4（美国Santa Cruz公司）；p-Akt、p-mTOR（美国Bioworld公司）。

1．2方法

1．2．1细胞培养与分组将常规方法复苏的HMCs培养于含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基中。选取NADPH氧化酶特异性抑制剂DPI、强效抗氧化剂Tempol、PI3K／Akt信号通路特异性抑制剂LY294002作为阳性药。将实验细胞分组如下：①正常组、胰岛素组（分别含1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L胰岛素）；②正常组、高胰岛素（64 nmol／L）组、DPI（10μmol／L）组、Tempol（100μmol／L）组、LY294002（10μmol／L）组与As-IV（25、50、100 μmol／L）组；③正常组、高胰岛素（64 nmol／L）组、DPI（10μmol／L）组、LY294002（10μmol／L）组与As-IV（25、50、100μmol／L）组；④正常组、高胰岛素（64 nmol／L）组、Tempol（100μmol／L）组、LY294002（10 μmol／L）组与As-IV（25、50、100μmol／L）组。

1．2．2MTT比色法检测细胞增殖取对数生长期细胞，0．25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培养基稀释成单个细胞悬浮液。以2×104／孔密度接种于96孔板。24 h后细胞贴壁、展开完全，小心吸弃培养液，各孔均加入200μl无血清培养基饥饿24 h使其同步化。轻轻弃掉上清液，按1．2．1①、1．2．1②分组，每组各设6个复孔，给药。1．2．1①继续培养12、24、48 h后，1．2．1②继续培养48 h后每孔加入20μlMTT（5 mg／ml），避光，恒温培养箱继续培养。4 h后小心弃掉上清液，每孔加入150μl DMSO，持续振荡使蓝紫色结晶完全溶解，10 min后于酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度（optical density，OD）值。

1．2．3DCFH-DA法测定细胞内ROS含量将单个HMCs悬浮液以3×105／孔密度接种于24孔细胞培养板。24 h后细胞贴壁、展开完全，小心吸弃培养液，各孔加入500μl无血清培养基饥饿24 h使其同步化。轻轻弃液，按1．2．1②分组，每组设3个复孔，给药。继续培养48 h后，每孔加入不含血清、含10μmol／L DCFH-DA的培养基500μl，37℃培养箱继续孵育20 min，每隔3 min或5 min摇晃混匀一次，使探针与细胞充分接触。用无血清培养基洗涤各孔3次，以充分清除未进入细胞内的DCFH-DA探针。荧光显微镜下随机选取3个不同区域拍照，采用IPP软件分析3个视野内绿色荧光强度的平均值，再对各组进行统计学分析。

1．2．4Western blot法检测细胞内NOX4、p-Akt、pmTOR蛋白的表达将单个HMCs悬浮液以4× 107／瓶密度接种于25 mm2细胞培养瓶中。24 h后细胞贴壁、展开完全，弃掉培养液，加入5 m l无血清培养基饥饿24 h使其同步化。弃液，分组同1．2．1③、1．2．1④。继续培养48 h后，弃液，用4℃预冷的PBS 5 m l洗2次，吸干瓶内液体后置于冰上。每瓶加入120μl裂解液，4℃摇床上充分裂解20～30 min后，用细胞刮刮下细胞并收集至1．5 m l EP管中。于4℃以12 000 r／min离心15 min。离心完毕后，收集上清液至500μl EP管中。BCA蛋白定量法测定各组蛋白含量。剩余蛋白以4∶1比例与5×上样缓冲液充分混合均匀后，置于100℃金属浴10 min以充分变性。于SDS-PAGE凝胶上电泳分离，其后电转移至 PVDF膜上，PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST于水平摇床上室温封闭2 h。TBST洗后加入一抗 NOX4（1∶500）、p-Akt（1∶1 000）、pmTOR（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）置于4℃摇床上孵育过夜。TBST洗后加入辣根过氧化物标记的二抗（1∶10 000）室温孵育2 h。TBST洗后用ECL化学发光法显影。最后用Image J软件分析灰度值。

1．3统计学处理采用SPSS 19．0统计软件进行分析，实验结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD检验。

2　结果

2.1胰岛素对HMCs细胞增殖的影响采用单因素方差分析进行主体间效应的检验（F值分别为12 h：3．59，24 h：3．78，48 h：7．72，P＜0．01）。LSD两两比较结果显示，与正常组比较，体外培养12、24、48 h后的胰岛素1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L组的OD值均有不同程度的上升，其中，12 h时，胰岛素64、128 nmol／L组；24 h时，胰岛素32、64、128 nmol／L组；48 h时，胰岛素32、64、128 nmol／L组与正常组比较差异均有统计学意义（P＜0．05，P＜0．01），表明胰岛素对HMCs细胞增殖有促进作用，并呈时间和浓度依赖性。见表1。

2.2As-IV对高胰岛素诱导的HMCs增殖的影响采用单因素方差分析进行主体间效应的检验（F＝12．48，P＜0．01）。LSD两两比较结果显示，与正常组比较，高胰岛素组在培养48 h后，OD值显著上升（P ＜0．01）。与高胰岛素组比较，各用药组OD值均下降，As-IV组随药物浓度的增加OD值依次降低（P＜0．05，P＜0．01），表明As-IV对高胰岛素诱导的HMCs增殖具有抑制作用，呈浓度依赖性。见表2。

2.3As-IV对高胰岛素诱导的HM Cs中ROS含量的影响采用单因素方差分析进行主体间效应的检验（F＝63．49，P＜0．01）。LSD两两比较结果显示，与正常组比较，高胰岛素组细胞内荧光强度明显增强，表明高胰岛素加重了细胞的氧化应激反应，使ROS含量升高（P＜0．01）。与高胰岛素组比较，各用药组细胞内荧光强度均出现不同程度减弱，表明ROS含量降低，氧化应激反应减弱，且As-IV降低细胞内ROS含量呈浓度依赖性（P＜0．05，P＜0．01）。见图1。

表1　不同浓度胰岛素对体外培养12、24、48 h 的HMCs增殖的影响（n＝6，±s）

表1　不同浓度胰岛素对体外培养12、24、48 h 的HMCs增殖的影响（n＝6，±s）

与12h正常组比较：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01；与24 h正常组比较：*P＜0．05，**P＜0．01；与48 h正常组比较：△P＜0．05，△△P＜0．01

OD值组别12 h　24 h　48 h正常0．235±0．015　0．333±0．008　0．532±0．013胰岛素（nmol／L）1 0．236±0．013　0．334±0．019　0．535±0．036 2 0．238±0．013　0．338±0．034　0．541±0．028 4 0．241±0．016　0．341±0．027　0．548±0．022 8 0．247±0．022　0．350±0．027　0．559±0．036 16　0．254±0．025　0．362±0．033　0．595±0．058 32　0．258±0．038　0．370±0．035*　0．615±0．068△64　0．261±0．024＃　0．384±0．050*　0．636±0．077△△128　0．271±0．026＃＃　0．404±0．040**0．685±0．042△△

表2　As-IV对高胰岛素诱导的HMCs增殖的影响（n＝6，±s）

表2　As-IV对高胰岛素诱导的HMCs增殖的影响（n＝6，±s）

与正常组比较：＃＃P＜0．01；与高胰岛素组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别　48 h OD值正常0．451±0．027高胰岛素（64 nmol／L）　0．579±0．013＃＃DPI（10μmol／L）　0．474±0．022**Tempol（100μmol／L）　0．452±0．032**LY294002（10μmol／L）　0．468±0．024**As-IV（μmol／L）25　0．520±0．042*50　0．494±0．030**100　0．456±0．038**

2.4As-IV对高胰岛素诱导的HMCs中NOX4、p-Ak t、p-m TOR蛋白表达的影响采用单因素方差分析进行主体间效应的检验（F值分别为 NOX4：12．02，p-Akt：13．85，p-mTOR：47．45，P＜0．01）。LSD两两比较结果显示，与正常组比较，高胰岛素组HMCs中NOX4、p-Akt、p-mTOR蛋白表达均显著增加（P＜0．01）。与高胰岛素组比较，DPI组、LY294002组、As-IV 25、50、100μmol／L组HMCs中NOX4蛋白表达下调；Tempol组、LY294002组、As-IV 25、50、100μmol／L组HMCs中p-Akt、p-mTOR蛋白表达也呈现不同程度的下调（P＜0．05，P＜0．01）。见图2。

3　讨论

2013年调查结果显示，根据国际最新临床诊断标准，我国成年人DM患病率为11．6%，约1．139亿人，其中，2型DM约占90%～95%。我国2型DM并发肾病的概率为34．7%。2型DM普遍存在胰岛素抵抗早有定论，在此基础上引发的HINS也相当常见，而HINS在联系DM与其他疾病中发挥着重要作用。微量白蛋白尿是早期DN的一个重要标志，其与肾脏疾病进程密切相关［8］。HINS与微量白蛋白尿或尿白蛋白排泄率存在明显联系已被大量流行病学研究［1］证实。对第三世界健康与营养调查发现，慢性肾脏疾病的患病率与HINS呈独立相关［2］。动物实验［3］表明，在 HINS阶段即可出现 DN的早期特征性病变即肾小球肥大。该实验模拟HINSDM患者体内的高胰岛素环境，选取肾脏固有细胞HMCs进行体外培养实验。结果显示，不同浓度胰岛素作用不同时间后，HMCs均有不同程度的增殖，呈现出一定的时间和浓度依赖性；其中64 nmol／L胰岛素作用48 h后，HMCs增殖显著、稳定，同时NOX4蛋白表达上调，ROS含量增加，表明高胰岛素不仅能促进HMCs的过度增殖，还可加重其氧化应激反应。DPI作为特异性的NADPH氧化酶抑制剂，作用于HMCs后，NOX4蛋白表达显著下降，ROS含量也明显减少，表明HMCs中ROS的产生主要来源于NADPH氧化酶。细胞氧化应激增强，不仅会对肾脏组织直接造成损伤，还可增加多种与肾脏疾病相关的信号通路的激活及细胞因子的合成分泌［9］。

PI3K／Akt／mTOR作为胰岛素的主要信号通路，也是体内重要的生存通路，在细胞的增殖、转录、肥大、能量代谢、凋亡等多种细胞功能中有重要作用。Akt参与构成细胞内多条信号通路，mTOR作为Akt的下游效应物，在DN发生发展中起重要调节作用，不仅与2型DM发病与进展有关，还与细胞外基质的积累、肾脏肥大以及肾小球基底膜增厚等相关［10］。实验结果显示，高胰岛素作用48 h后，p-Akt、p-mTOR蛋白表达增加，提示高胰岛素可通过激活PI3K／Akt／mTOR信号通路加重肾损伤。

黄芪作为常用中药，已被证实具有多种药理作用，该实验主要探讨As-IV防治DN作用及机制。结果显示，各阳性药及As-IV组均能有效抑制高胰岛素诱导的HMCs细胞增殖，推测这可能是As-IV发挥保护作用的细胞学基础。同时各用药组亦能有效降低ROS含量，提高细胞抗氧化应激能力。此外各用药组还能下调p-Akt、p-mTOR蛋白表达，抑制PI3K／Akt／mTOR信号通路的过度激活，减轻肾损伤。抗氧化剂Tempol在强效清除ROS的同时也可抑制Akt蛋白的过度磷酸化；PI3K／Akt信号通路抑制剂LY294002在抑制该信号通路激活的同时也可减少ROS含量，表明ROS可参与Akt蛋白的磷酸化，而磷酸化的Akt也可增加ROS含量，ROS与Akt蛋白的磷酸化存在正相关。推测ROS与PI3K／Akt信号通路在DN的发生发展中存在协同作用，提示As-IV可以通过作用于以上两个靶点，发挥其对HMCs的保护作用。

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Protective effects of As-IV on high insulin induced human mesangial cells injury and itsmechanism s

Li Guiping，LiWeizu，Duan Wenting，et al
（Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the protective effects of astragalosides IV（As-IV）on high insulin induced human mesangial cells（HMCs）injury in vitro and itsmechanisms．MethodsWe used HMCs as research object，treated HMCswith different concentrationsand time of insulin，analyzed the proliferation by MTT assay to select the dose-and time-dependentmanners of insulin．The HMCs was divided and treated as follows：normal group（NG），high insulin group（HINS，64 nmol／L），DPI（10μmol／L），Tempol（100μmol／L），LY294002（10μmol／L）and As-IV（25，50，100μmol／L）．After treatment for 48 hours，the proliferation of HMCswas analyzed by MTT assay．The reactive oxygen species（ROS）production wasmeasured by 2，7-dichlorodihydto fluorescin diacetate （DCFH-DA）．The expressions of NADPH oxidase 4（NOX4），phosphor-protein kinase b（p-PKB）also named p-Akt and phosphor-mammalian target of rapamycin（p-mTOR）were analyzed byWestern blot．ResultsThe proliferation of HMCswas enhanced in a dose-and time-dependentmanner by increasing concentrations and time of insulin．Compared with HINS group，DPI，Tempol，LY294002，As-IV treatment significantly inhibited HMCs proliferation，reduced intracellular ROS contents and decreased expression of NOX4，p-Akt and p-mTOR（P＜0．05，P＜0．01）．ConclusionInsulin promotes proliferation of HMCs in a time-and dose-dependent manner．As-IV has protective effects on high insulin induced HMCs injury due to inhibition of HMCs proliferation，oxidative damage，NOX4，p-Akt and p-mTOR expression．

Key wordshigh insulin；humanmesangial cells；astragalosides IV；ROS；p-Akt；p-mTOR

中图分类号R 587．1；R 285．5

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1629-05

基金项目：国家自然科学基金（编号：81173624）；安徽省国际合作项目（编号：1230603007）；安徽省教育厅自然科学基金（编号：KJ2012A192）

作者单位：1安徽医科大学药理学教研室，合肥230032

作者简介：李贵平，女，硕士研究生；