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4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人胃癌SGC-7901细胞的磷酸化蛋白质组学研究

2015-07-20王佳丽陈飞虎乔文豪张冬玲

安徽医科大学学报 2015年11期
关键词:细胞株组学磷酸化

王佳丽,夏 泉,2,陈飞虎,乔文豪,张冬玲

◇药学研究◇

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人胃癌SGC-7901细胞的磷酸化蛋白质组学研究

王佳丽1,夏泉1,2,陈飞虎1,乔文豪1,张冬玲1

摘要目的研究观察新型维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(ATPR)作用于胃癌SGC-7901细胞后蛋白质的磷酸化情况来了解ATPR诱导分化作用的可能机制和作用靶点。方法ATPR作用于胃癌SGC7901细胞48 h后,收集并提取总蛋白,通过胰蛋白酶酶解,TiO2磁珠法富集磷酸肽,高分辨率液质联用仪器检测磷酸肽,使用Proteome Discoverer1.2软件寻找差异的蛋白质和磷酸化位点,利用生物信息学网站和DAVID、KEGG、IPA软件,分析这些磷酸化蛋白质的功能及亚细胞定位等信息。结果最终鉴定出109个蛋白质,其中45个磷酸化蛋白质,共有121个磷酸化位点,差异蛋白中有15个仅出现在ATPR组,20个仅出现在正常组。DAVID分析结果显示差异磷酸化的蛋白质参与调控细胞进程、生物进程、基因表达、细胞的代谢过程等;KEGG分析结果显示差异磷酸化蛋白质主要有参与ERBB信号通路、RNA的转运、内质网蛋白加工过程、p53信号通路等。IPA软件分析一些差异蛋白质之间的关联蛋白是泛素连接酶(UBC)。结论ATPR对胃癌细胞SGC-7901细胞诱导分化的机制可能是通过作用于多种蛋白质或基因,如肝癌衍生生长因子(HDGF)、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)、ATP结合盒G亚族蛋白4(ABCG4)和腺苷酸环化酶关联蛋白1(CAP1)而发挥作用,并通过影响这些蛋白质的磷酸化从而实现ATPR对胃癌细胞的诱导分化作用。

关键词ATPR;人胃癌SGC-7901细胞;诱导分化;磷酸化蛋白质组学

2015-06-29接收

2安徽医科大学第一附属医院药剂科,合肥230022

夏泉,男,硕士生导师,责任作者,E-mail:xiaquan2010@163.com

全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)作为常用诱导分化剂已广泛应用,在临床上主要用于急性早幼粒细胞白血病的治疗,其机制是能诱导肿瘤细胞分化成正常细胞或诱导肿瘤细胞凋亡,从而达到治愈目的。临床发现维甲酸类药物有严重的综合征、耐药以及复发率高等缺陷,使得其应用受限。实验室以ATRA为先导化合物,对其进行结构修饰,再经过体外药效学筛选,发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)具有较强的抗肿瘤增殖和诱导分化活性,期望开发成为一种新型抗肿瘤药。该研究以人胃癌细胞株SGC-7901为研究对象,通过磷酸化蛋白质组学的方法,研究ATPR作用于胃癌细胞后蛋白质的表达变化,并找到作用靶点来解释其可能诱导分化作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株与药物SGC-7901细胞株购自中科院上海细胞库。ATPR由安徽医科大学药学院合成,纯度为99.66%,以无水乙醇溶解配制成浓度为2×10-2mol/L的贮存液,-20℃避光保存,见图1。

1.1.2主要试剂与仪器磷酸酶抑制剂(货号88667)和去污剂去除树脂(货号87778)购自美国Pierce公司;Trypsin(货号V5280)购自美国Promega公司;二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide,IAM)购自美国Sigma公司;羟基乙酸和25%氨水溶液购自美国Aladdin公司;Strata-X固相小柱(60 mg/3 ml)购自美国Phenomenex公司;TiO2Mag sepharose(货号28-9440-10)购自英国GE healthcare;BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司;丙酮、乙腈、醋酸、甲酸、三氟乙酸为色谱级。酶标仪、ACCELA 600 Pump液相色谱、傅立叶变换静电场轨道肼质谱(LTQ Orbitrap XL)、Xcalibur2.1工作站和 Proteome Discoverer软件购自美国Thermo公司;高速冷冻离心机购自美国Beckman公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和加药收集处理胃癌SGC-7901细胞株为贴壁生长细胞株,采用含10%小牛血清(FCS)的高糖DMEM(青霉素100 IU/ml和链霉素100μg/ml)培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中,每2 d更换培养液1次,取处于对数生长期的细胞进行实验。将其分为两组,ATPR组:ATPR药物终浓度为1×10-6mol/L;正常组:0.05%无水乙醇的培养基,孵育48 h后收集细胞。

1.2.2磷酸化蛋白质组学样品制备收集细胞,加入500μl裂解液(临用前加入2μl蛋白酶抑制剂与5μl磷酸酶抑制剂),摇床震荡裂解约15 min后,14 000 r/min 4℃离心15 min,吸出上清液,总蛋白定量后取1 mg细胞总蛋白,加入丙酮过夜沉淀。离心收集沉淀后加入125μl复溶液(尿素7 mol/L、硫脲2 mol/L、CHAPS 65 mmol/L),完全溶解后加入875 μl 50 mmol/L NH4HCO3混匀。蛋白溶解液加入10 μl 100 mmol/L的DTT,50℃15 min;加入10μl300 mmol/L的IAM,避光放置15 min,加入20μg胰酶(酶∶蛋白=1∶50)于37℃恒温水浴锅过夜孵育17 h。使用去污剂去除树脂处理酶解液,室温孵育2 min后,1 000 r/min离心2 min,收集液体脱盐处理。

1.2.3脱盐Strata-X柱活化柱子和平衡后加载酶解液样品,Milli-Q水洗柱子,1 000 r/min离心2 min去除残留水液。加入2%甲酸/98%甲醇收集洗脱液,真空浓缩仪旋转蒸发干燥。

1.2.4磷酸肽的富集(TiO2磁珠法)吸出50μl重悬的磁珠胶浆加入500μl结合缓冲液(1 mol/L羟基乙酸、80%乙腈、5%TFA),置于磁场中吸去液体;脱盐后的样品加入250μl溶液,加入磁珠内室温孵育30 min后,吸去液体;加入500μl结合缓冲液洗涤后吸去液体,再加入500μl洗涤缓冲液并吸去液体;加入50μl 5%氨水洗涤磁珠,收集液体于真空浓缩仪干燥。

1.2.5高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析富集的磷酸化样品用LC-MS/MS检测。干燥样品溶解于30μl0.1%甲酸,流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为100% 乙腈溶液,使用180 min梯度洗脱样品:0~10 min,B相为10%;10~110 min,B相从10%上升至40%;110~140 min,B相从40%上升至95%;140~165min,B相维持95%;165 ~170 min,A相从5%上升至90%;170~180 min,A相维持90%。洗脱肽段经由纳升级电喷雾离子源接口喷出,进入LTQ Orbitrap XL高分辨率质谱仪进行进行质谱分析。具体质谱条件如下:采用数据依赖模式,在正离子模式下进行扫描,电喷雾电压:3.8 kV;离子传输毛细管温度为200℃;质量扫描范围:300~2 000;一级质谱Orbitrap分辨率:60 000;10个LTQ串级质谱扫描;母离子窗口:2 Da;串级质谱碰撞归一化能量:35;中性离子丢失:97.98、65.32、45.99、32.66。

1.2.6磷酸化蛋白质的鉴定和生物信息学分析通过Proteome Discovery 1.2软件对质谱产生的数据文件进行Sequest搜索,数据库为人源的蛋白序列数据库,来源于ftp://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/proteomes/。检索参数如下:M/Z为350~5 000 Da,母离子容忍度为10 ppm,碎片离子容忍度为0.8 Da,半胱氨酸的烷基化修饰Carbamidomethyl/+57.021 Da(C)为固定修饰,甲硫氨酸的氧化Oxidation/+15.995 Da (M)为可变修饰,丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上的磷酸化修饰(Phospho/+79.966 Da,S、T、Y),肽段和蛋白质鉴定FDR均小于1%,磷酸化肽段的过滤时选择肽段可信度为高。差异磷酸化蛋白质用DAVID、KEGG和IPA进行生物信息学分析。

1.3统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析,实验结果以±s表示。

2 结果

2.1质谱分离和鉴定效果的验证结果在对总蛋白量为1 mg样品进行磷酸化蛋白质组学研究的同时,使用标准牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)验证酶解效果并事先饱和毛细管柱。BSA经数据库比对,肽段覆盖率达51.56%,得分值为316,说明分离效果较好,可以用于后续的正式实验。

2.2磷酸化蛋白质的鉴定结果通过TiO2磁珠富集磷酸肽和质谱仪器进行鉴定,鉴定出45个差异磷酸化蛋白质,121个磷酸化位点,其中丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸位点分别为81、34、6个;这些差异磷酸化蛋白质中有15个仅出现在ATPR组,20个蛋白质仅出现在正常组。肝癌衍生生长因子(hepatoma-derived growth factor,HDGF)、钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)、ATP结合盒G亚族蛋白4(ATP-binding cassette sub-family Gmember4,ABCG4)和腺苷酸环化酶关联蛋白1(adenylyl cyclase-associated protein 1,CAP1)的磷酸化发生变化,可能是ATPR作用后的结果,见图2。

2.3磷酸化蛋白质的功能分析通过DAVID分析已鉴定的差异磷酸化蛋白质的生物进程、细胞组成及分子功能,这些蛋白质主要参与蛋白质和大分子的代谢过程、蛋白质的生物合成过程、基因表达等,并主要参与构成细胞核(22.2%)、细胞质(22.2%);经过分子功能分析,发现这些差异蛋白质主要参与蛋白质与核酸的连接。KEGG pathway分析差异磷酸化蛋白质可能参与的信号通路,主要有ERBB信号通路、RNA的降解、RNA的转运、内质网蛋白加工过程、剪接体形成、p53信号通路等,见图3。

2.4磷酸化蛋白质的关联分析IPA软件分析差异蛋白质之间的关联性,发现泛素连接酶(ubiquitin ligase,UBC)成为了CAST与CAP1、DNA同源家族C蛋白5(dnaJ homolog subfamily Cmember 5,DNAJC5)与核帽连接蛋白1(nuclear cap-binding protein subunit 1,NCBP1)、结节蛋白(tuberin,TSC2)与 mRNA脱帽增强蛋白4(enhancer of mRNA-decapping protein 4,EDC4)之间的关联蛋白质,提示泛素连接酶参与了调节RNA和凋亡的各个过程,见图4。

3 讨论

课题组前期以ATRA为先导化合物设计合成了维甲酸衍生物ATPR,并证实其对白血病[1]、卵巢癌[2]、乳腺癌[3]等多种肿瘤细胞株具有良好的抑制增殖和诱导分化作用。磷酸化蛋白质组学技术在肿瘤的发生发展以及抗肿瘤作用机制研究中已广泛应用,蛋白质的磷酸化水平的变化更能反映蛋白质的表达变化。该研究是对ATPR作用于胃癌SGC-7901细胞后细胞内磷酸化蛋白质组学的研究,结果表明HDGF、CAST、ABCG4和CAP1发挥重要作用,并通过影响这些蛋白质的磷酸化从而实现ATPR对胃癌细胞的诱导分化作用。

HDGF是Nalamura et al[4]在人肝癌细胞系(HuH-7)无血清培养的上清液中分离得到的一种生长因子,具有一系列生物功能,在促进癌细胞增殖、侵袭、迁移等过程发挥重要作用,包括食管癌[5]、肺癌[6]、黑色素瘤[7]等。临床病理学分析[8]表明HDGF的高表达与乳腺癌、胰腺癌的预后差有联系。ABCG4是ATP结合盒转运蛋白家族成员,张志培等[9]发现ABCG4在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中表达升高,并发现ABCG4有外排药物引起肿瘤耐药的可能性,可成为耐药的潜在靶点。本研究中HDGF和 ABCG4仅在正常组出现磷酸化,可能是ATPR作用后抑制了它们的表达,从而可能减少耐药性的发生。CAP1是细胞骨架蛋白,参与调节肌动蛋白细胞骨架。Hua et al[10]发现,CAP1在上皮卵巢癌细胞EOC细胞中高表达,敲除CAP1基因结果提示下调CAP1在肿瘤中的表达是治疗EOC的新的靶点。S307/309位点发生磷酸化对CAP1的活性具有调节作用。而本研究中CAP1磷酸化位点S307和S309仅在正常组中出现,验证了CAP1在肿瘤细胞骨架中的调节作用。

参考文献

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[3]汪楠,陈飞虎,葛金芳,等.4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对MCF-7细胞增殖和分化的影响及其机制研究[J].中国药理学通报,2013,29(6):767-72.

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[10]Hua M,Yan S,Deng Y,et al.CAP1 is overexpressed in human epithelial ovarian cancer and promotes cell proliferation[J].Int J Mol Med,2015,35(4):941-9.

The phosphoproteom ics of the differentiation of 4-am ino-2-trifluorom ethyl-phenyl retinate on
human gastric cancer SGC-7901 cells

Wang Jiali1,Xia Quan1,2,Chen Feihu1,et al
(1College of Pharmacy,AnhuiMedical University,Hefei230032;2Dept of Pharmacy,
The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University,Hefei230022)

AbstractObjectiveTo investigate levels of phosphorylation of protein when the new retinoid derivatives 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate(ATPR)on gastric cancer SGC-7901 cells,which could help to understand the possible mechanism of differentiation,and found the targets by phosphoproteomics.MethodsGastric cancer SGC-7901 cellswere incubated for48 hourswith ATPR,collected and extracted of total cell protein,digested by trypsin,phosphopeptideswere enriched by TiO2beads and analyzed by LC-MS/MS.Used Proteome Discoverer1.2 to find different proteins and phosphosites.Bioinformatic was applied to analyze the function and subcellular localization of phosphorylated proteins to explain these different proteins by DAVID,KEGG,IPA software.Resu ltsWe identified 109 proteins,including 45 phosphoproteins and 121 phosphosites by analysis of MS.15 proteins appeared on the ATPR group and 20 proteins in the control group.DAVID analysis results displayed that different phosphorproteins were involved in regulating cellular process,biological process,gene expression,metabolic process and so on;the molecular functions of different phosphoproteinsmay include protein binding and nucleic acid binding.ERBB signaling pathway,RNA transport,Protein processing in endoplasmic reticulum,p53 signaling pathway were involved by KEGG analysis.IPA software results displayed that the ubiquitin ligase(UBC)became associated protein of several proteins.ConclusionATPR can induce differentiation of gastric cancer cell SGC-7901,themechanism may be the results of interaction of proteins or genes,such as HDGF,CAST,ABCG4 and CAP1,and regulate the phosphorylation of these proteins.

Key wordsATPR;gastric cancer SGC-7901 cells;induced differentiation;phosphoproteomic

中图分类号R 341

文献标志码A

文章编号1000-1492(2015)11-1625-04

基金项目:国家“重大新药创制”科技重大专项(编号:2011ZX09401-021)

作者单位:1安徽医科大学药学院,合肥230032

作者简介:王佳丽,女,硕士研究生;

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