高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱联用测定生物样品中的有机汞

王晓雯 王 炜 李玉璞

(大连市环境监测中心，辽宁 大连 116023)

汞是是自然界中常见的污染物之一，其毒性依赖于它的化学形态及其浓度，有机汞的毒性要比无机汞的强。其中甲基汞是有机汞中毒性最强的汞化合物之一。研究表明，在微生物的作用下，环境中的无机汞可以通过生物甲基化、乙基化、苯基化等反应生成相应的有机汞，而有机汞可被动植物吸收，并通过食物链富集，最终危害人类健康［1］。鉴于不同形态汞化合物的毒性差异，采用高灵敏度的形态分析方法测定环境样品和生物样品中汞的含量非常必要［2］。

目前，高效分离技术与高灵敏度的检测技术联用已经成为汞形态分析的主要手段。气相色谱(GC)和液相色谱(HPLC)是常用的分离手段，原子荧光光谱(AFS)，原子吸收光谱(AAS)，电感耦合等离子体－原子发射光谱(ICP－AES)以及电感耦合等离子体质谱(ICP－MS)作为检。测手段广泛应用于汞形态的分析。其中HPLC－ICP－MS 以其灵敏度高、线性范围宽、检出限低等优点，成为各联机应用分析汞形态的首选［3－10］。

分析生物样品中的有机汞的前处理方法主要是以酸提取，碱消解和微波消解为主，使用HPLC－ICP－MS联用技术进行分析，由于苯基汞需高比例有机相的洗脱，易造成ICP－MS 熄火，因此目前应用该方法进行汞的形态分析主要集中在甲基汞和乙基汞上，仅有曹程明［11］，彭国俊［12］和张兰［13］等人在各自的研究中涉及到了生物体中的苯基汞，其中，只有曹程明在研究中做了苯基汞的回收率研究。本文在酸提取的基础上，以苯作为萃取溶剂，用超声辅助萃取，硫代硫酸钠溶液作为反萃取剂进行样品前处理，用HPLC 分离，ICP－MS 仪器增加了加氧装置和有机专用矩管，建立了测定生物样品中甲基汞、乙基汞和苯基汞的分析方法。所建立的HPLC－ICP－MS 方法在10min 内即可完全分离分析3种有机汞形态，大大缩短了样品的分析时间，适合于生物样品中汞形态的快速萃取分析要求。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Agilent 7500ce ICP－MS，配备加氧装置和1.5mm有机矩管;Agilent 1200 HPLC;超声波清洗器;离心机;振荡仪;冻干机。

L－半胱氨酸(优级纯);乙酸铵(优级纯);苯(色谱纯);甲醇(色谱纯);浓盐酸溶液(ρ=1.19g/mL);硫代硫酸钠(c=0.01mol/L);甲基汞、乙基汞、苯基汞标准贮备液(ρ=10μg/mL)。

1.2 仪器工作参数

1.2.1 高效液相色谱参数设置

Agilent Zorbax Plus C18色谱柱，4.6mm×150mm，5μm;流动相:A 相为0.01moL/L 乙酸铵/0.12% L－半胱氨酸，氨水调节pH=7.5，经0.45μm 滤膜过滤;B相为甲醇。流动相流速为1.0mL/min，进样量50μL;梯度洗脱，总时间为20min。洗脱条件见表1。

1.2.2 电感耦合等离子体质谱仪参数设置

入射功率1500W;采样深度10.0mm;玻璃同心雾化器;石英雾化室与炬管;雾室采用半导体控温于－5℃;Pt 采样锥和截取锥;采样模式:Time program．同位素:Hg202，积分时间0.5s。对应梯度洗脱条件分别设定最匹配的ICP－MS 仪器参数，梯度洗脱过程中采用合适的调谐文件，以保证梯度洗脱过程中各阶段汞的灵敏度均最佳，氧氩混合气比例见表1。

表1 液相色谱洗脱条件及质谱调谐文件设定

1.3 样品的采集和前处理

取生物体的可食部分，依次用去离子水和超纯水洗净后，再用纱布拭干水分，打碎均匀后，然后置于冻干机冷冻干燥72h，充分干燥后粉碎成干粉储存于密闭玻璃瓶中，冷冻保存。同时准确记录冻干前后重量，并由此获得样品水分含量。

称取0.2g 干样品于50mL 的离心管中，加入10mL超纯水，5mL 浓盐酸和10mL 苯，超声萃取25min，振荡10min，5000r/min 离心10min，将上清液转移至另一50mL 的离心管中。下层溶液加入5mL 苯，重复上述操作，合并上清液。加入5mL 硫代硫酸钠溶液超声萃取30min，离心，下层水溶液过膜进样。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的选择

王炜等在研究中使用Zorbax Plus C18色谱柱，乙酸铵/L－半胱氨酸，甲醇体系下，采用梯度洗脱程序进行3 种有机汞形态的分离［14］。经过研究比较，6min 之前均采用92%醋酸铵/L－半胱氨酸溶液+ 8%甲醇以便实现甲基汞、乙基汞的迅速分离，分离度与峰形均较为理想，在6min 后将甲醇比例直接提高至45%以实现苯基汞的快速洗脱。10min 内可以实现3 种有机汞的完全分离。在苯基汞分离之后，为保证下一个样品的正常分析，11min 后恢复至92%醋酸铵/L－半胱氨酸溶液+8%甲醇体系，直至20min 样品分析完毕。图1 为浓度为10μg/L 的3 种有机汞形态的色谱分离图，保留时间依次为甲基汞2.260min，乙基汞4.270min，苯基汞9.340min。

2.2 萃取溶液的选择

曹程明在他的研究中采用盐酸－甲苯为提取试剂，L－半胱氨酸溶液反萃取，前处理效果良好，甲基汞的回收率大于70%，乙基汞和苯基汞的回收率均大于50%［11］。由于甲苯为易制毒试剂，采购程序复杂，本研究使用苯替代甲苯作为提取溶剂。

2.3 反萃取液的选择

图1 3 种有机汞的谱图

由于单纯采用L－半胱氨酸溶液进行反萃取，乙基汞的回收率不稳定，而大多数研究均采用硫代硫酸钠溶液反萃取，甲基汞、乙基汞和苯基汞的回收率较高［11］。

因此，本研究使用盐酸－苯为提取试剂，超声萃取后，硫代硫酸钠溶液反萃取的样品前处理方法，所得的甲基汞和乙基汞的回收率大于90%，苯基汞的回收率大于50%。

2.4 校准曲线的制备

用流动相配制浓度为0.50，1.00，5.00，10.0，50.0μg/L 的混合标准溶液，并进行测定。对不同浓度的甲基汞、乙基汞以及苯基汞所对应的峰积分面积作图，线性范围和回归方程见表2。甲基汞、乙基汞和苯基汞均在0.50～50.0μg/L 范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数均大于0.9998。

表2 不同汞形态的线性范围和回归方程

2.5 方法检出限、精密度和准确度

由于鱼肉和贝类样品中含有甲基汞，在检出限的测定中，向0.2g 样品中加入2.50ng 的乙基汞和苯基汞标准物质，另外加入25.0ng 的三种标准物质混合物做加标回收实验。在上述条件下测定生物样品，盐酸－苯为提取试剂，超声萃取后，硫代硫酸钠溶液反萃取后，相应的萃取液浓度分别为0.50μg/L(乙基汞和苯基汞)和5.00μg/L，上机测试，平行测定7 次，做加标回收试验，同时计算方法检出限、精密度和准确度。鱼肉中甲基汞的检出限为0.030mg/kg，乙基汞的检出限为0.013mg/kg 苯基汞的检出限为0.010mg/kg;贝类中甲基汞的检出限为0.038mg/kg，乙基汞的检出限为0.019mg/kg，苯基汞的检出限为0.015mg/kg。不同浓度样品的相对标准偏差在1.6%－12.2%之间，两个水平加标回收率在50.8～129%之间，结果见表3。

表3 样品测定与加标回收试验结果

3 结 论

本文采用酸提取法进行样品前处理，并利用HPLC－ICP－MS 联用技术建立了鱼肉和贝类中汞形态的分析方法。在前处理方法和色谱、质谱实验条件优化下，选择以盐酸－苯为提取试剂，超声萃取后，硫代硫酸钠溶液反萃取，以L－半胱氨酸为螯合剂，Plus C18柱分离汞化合物形态。将所建立的方法应用于生物样品中的汞形态分析，灵敏度高，3 种有机汞的方法检出限在0.010～0.038mg/kg 以内，以加标回收的方式研究了该方法对生物样品的适用性，加标回收率在50.8～129%之间，两个添加水平的回收率和精密度均能满足日常分析需要，方法准确、可靠，为生物样品中的汞形态分析测定提供了有用的参考。

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