滤纸干血斑DNA自动化提取及其在地中海贫血基因诊断中的应用

黄烁丹 占伟 邹婕 庄宇嫦 熊蓉 朱莎莎 张华能 栾国彦

临床研究论著

滤纸干血斑DNA自动化提取及其在地中海贫血基因诊断中的应用

黄烁丹 占伟 邹婕 庄宇嫦 熊蓉 朱莎莎 张华能 栾国彦

目的研究滤纸干血斑(DBS)DNA 的自动化提取方法及其在地中海贫血(地贫)基因诊断中的应用。方法将276份经静脉血标本基因检测确诊为地贫的孕妇外周血标本按照研究需要分别制成240份合格、18份渗透不良和18份重复滴血滤纸干血斑标本，并模拟不同的运输和储存条件。使用 Lab-Aid 820 核酸提取仪对滤纸干血斑进行DNA提取，考察不同的起始血斑用量检测的准确度，对提取的DNA进行浓度和纯度分析，并分别使用荧光PCR熔解曲线法和PCR联合膜杂交法对DNA进行地贫基因检测。结果276份滤纸干血斑标本提取的DNA浓度9.85～29.56 ng/μl，纯度1.63～1.95，均能满足试剂盒检测要求，其中2种基因型检测方法的检测结果100%符合，2种方法均检出地贫基因突变IVS-Ⅱ-654 (C>T)、-28(A>G)、CD17 (A>T)、CD26 (G>A)、CD41/42 (-TTCT)、--αSEA、-α3.7、--α4.2、αCSα，所有结果均与使用静脉血提取DNA作为标本的检测结果100% 符合，覆盖了目前临床上常见的各种基因型。结论DBS标本对运输、保存要求较低，结合自动化核酸提取仪提取DNA，操作简单、提取结果稳定，可用于临床筛查地贫基因。

干血斑；地中海贫血；DNA 提取；荧光PCR 熔解曲线法

地中海贫血(地贫)即珠蛋白生成障碍性贫血，为一种常染色体隐性遗传病，是由珠蛋白基因的缺失或者点突变，使珠蛋白肽链合成障碍或速率降低、血红蛋白产量减少所引起的一组常染色体隐性遗传性溶血性贫血[1-2]。该病是我国南方常见的遗传性贫血病，在我国广东、广西、四川多见，长江以南各省区有散发病例[3]。目前对地贫尚无有效的治疗方法，因此通过婚检及产前筛查等途径进行大规模的人群筛查和诊断，发现携带地贫基因的夫妻，在妊娠早期进行产前基因诊断，对产前诊断为中重型地贫的胎儿进行终止妊娠，是防止中重型地贫儿出生、提高出生人口素质的有效措施。目前，裂口PCR、反向点杂交、实时荧光PCR熔解曲线法等相关技术已成为当下最普遍的地贫诊断方法[4]。现阶段，临床用于地贫基因诊断的标本主要来自受检者的静脉血。但是，这种方法在标本采集、分离、保存和运输过程中不可避免地会遇到一些难题。此外，受生物危险品运输限制，全血需专人冷链运输。随着我国产前筛查、新生儿筛查力度的不断增强，特别是当筛查范围扩大到一些地域偏远、医疗条件相对落后的地区时，应用滤纸干血斑(DBS)对于患者标本采集、保存和运输就更为有利[5]。从DBS标本中提取到符合应用要求的 DNA，则是各种诊断方法有效开展的必要前提。本研究旨在寻找一种有效、稳定、快速的DBS DNA 自动化提取方法并将其应用在地贫基因诊断中，现报告如下。

材料和方法

一、标本来源

收集2014年1～5月在梅州市妇幼保健院诊治、经静脉血基因检测确诊为地贫的276例孕妇外周血标本。

二、主要试剂和仪器

Whatman 903号滤纸(Whatman，英国)，Lab-Aid 核酸(DNA)分离试剂盒(厦门致善生物科技有限公司)，地贫基因荧光PCR熔解曲线法检测试剂盒(厦门致善生物科技有限公司)，α-和β-地贫基因检测试剂盒(PCR+膜杂交法)(广东凯普生物科技股份有限公司)，Lab-Aid 820核酸提取仪(厦门致善生物科技有限公司)，SLAN96s四色荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司，中国)，Nanodrop 2000 分光光度计(Thermo Scientific，美国)。

三、方法

1.DBS标本的制备

按研究的需要分别制成240份合格、18份渗透不良、18份重复滴血的DBS标本。标本采集使用Whatman 903号滤纸，合格的标本是指在每张滤纸上滴3滴血(40～50 μl)，血斑直径>8 mm，渗透充分。渗透不良标本制备时取25 μl血液，平涂于滤纸采样圈上，滤纸背面只有少量血渗透过去。重复滴血标本制备时取25 μl血液标本，滴于采样圈中，再取25 μl标本重复滴于采样圈的同一位置。之后室温条件下自然干燥4 h，独立包装并密封即制成DBS标本。

2.DBS标本的保存和处理

所采集的276例标本，按表1的条件模拟采集、运输、保存和极端情况下可能出现的各种情形，进行血斑标本运输及保存条件研究。其中，4℃ 3 d、室温3 d是标本运输、保存过程中最常用的条件，在血斑上打下8片直径3 mm的血片是进行DBS核酸提取的常规用量。

3.标本的DNA提取

DBS标本：分别使用打孔钳从血斑标本采样圈中打下8～12片直径3 mm的血片，收集在1.5 ml离心管中。每份标本取用后，均用酒精棉擦拭并灼烧打孔钳头部，避免交叉污染。提取步骤：向装有血片的离心管中加入500 μl裂解液，56℃孵育1 h。将经过孵育处理的液体加入DNA分离试剂盒试剂条的第一个孔位中，所有标本加入完成后，将放置提取试剂条的载架放入Lab-Aid 820核酸提取仪提取操作室中，选择血斑标本提取程序，仪器自动完成提取。使用Nanodrop 2000 分光光度计进行吸光值检测，计算DNA浓度和纯度。然后使用荧光PCR熔解曲线法和PCR+膜杂交法2种不同检测方法对应试剂盒进行地贫基因检测，按照说明书进行操作。

表1 DBS标本摸拟采集、运输和保存条件设计

静脉血标本：取200 μl混匀的静脉血标本加入Lab-Aid核酸(DNA)分离试剂盒试剂条的第一个孔位中，所有标本加入完成后，将放置提取试剂条的载架放入Lab-Aid 820核酸提取仪提取操作室中，选择血液标本提取程序，仪器自动完成提取。分别使用荧光PCR熔解曲线法和PCR+膜杂交法两种不同检测方法对应试剂盒进行地贫基因检测，按照说明书进行操作。

四、统计学处理

使用SPSS 13.0软件处理数据。计量资料以中位数(上、下四分位数)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验，如各组总体出现差异，再行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、DBSDNA吸光值检测结果

所有276份的DBS标本提取的浓度及纯度均在正常范围内。其中，1组标本提取的DNA浓度明显高于2～10组(H=56.24，P<0.001)；与2、3、6组比较，4、5组标本提取的DNA浓度稍低(P<0.05)，渗透不良的9组DBS标本DNA浓度明显偏低(P<0.001)，重复滴血的10组DBS标本DNA浓度和2～8组比较差异无统计学意义(P>0.05)，具体吸光值结果见表2。

二、地贫基因检测结果

所有276份的DBS DNA和静脉血DNA标本中，2种检测试剂盒均正常检出276例阳性突变，分别为IVS-Ⅱ-654 (C>T)66例、-28(A>G)27例、CD17 (A>T)15例、CD26 (G>A)9例、CD41/42(-TTCT)45例、--αSEA75例、-α3.715例、--α4.218例、αCSα 6例，检测结果覆盖了目前市面上各种常见地贫基因型；4组检出结果符合率达100%。

表2 DBS标本DNA吸光值检测结果[中位数(上、下四分位数)]

讨 论

地贫是我国南方常见的常染色体隐性遗传性疾病，据统计广东省β-地贫携带率为1.83%～3.36%。近年我国地贫筛查力度逐淅加强，用于进行基因检测的标本范围从常规的抗凝全血发展到孕早期胎儿绒毛、羊水、脐带血、孕妇外周血血浆中胎儿游离DNA及DBS[6-7]。本研究模拟各种检测时可能出现的条件，设计了对不同用量、不同保存条件、不同运输条件(模拟)、不同状况的DBS标本进行DNA 提取并应用于后续基因检测。结果显示，采样点多的DBS标本所提取的DNA浓度较高，在不同保存及运输条件下的正常DBS标本，所提取的DNA均可以满足常规地贫检测试剂盒的使用要求。这可能是DBS标本中血斑已经干燥、且独立包装及密封储存，受温度及储存时间的影响较小有关。针对渗透不良及重复滴血血斑的检测结果亦表明，此类血斑在常规保存、运输后提取的核酸亦可满足常规地贫基因检测要求。结果表明，DBS标本克服了抗凝全血在采集、运输、保存等方面存在的不便。本研究中各组条件提取的DNA吸光值检测及基因检测结果均正常，证明该方法可以应用于对某地区进行大规模的地贫防控工作。而且在新生儿筛查方面，用于制作干血斑所需的血液用量少，且从新生儿足跟取样，把对新生儿的有创伤害降到了最小。

随着地贫分子诊断技术朝着自动化和低成本的方向发展，简单、快速、稳定的核酸产物制备方法备受青睐[5]。本研究选用了Lab-Aid 820核酸提取仪进行276份血斑标本DNA的提取。相比传统的Chelex100法，Lab-Aid 820核酸提取仪无需在提取过程中进行长时间孵育，且提取产物中无杂质残留，对后续PCR反应基本无抑制；而相比目前使用较多的离心柱法，Lab-Aid 820核酸提取仪使用预封装的试剂盒，加入标本后，仪器仅需一键操作即可进行提取，使用更便捷，省去了大量的人力成本，且能有效的避免人工操作误差。Lab-Aid 820核酸提取仪可以一次性处理20份标本，仪器提取运行时间为35 min左右。在本研究中，使用Lab-Aid 820 核酸提取仪提取276份DBS标本共进行了14次操作，从准备血斑标本、标本消化预处理(60 min)到仪器完成提取，单次提取所耗时间约110 min。提取的DBS DNA分别应用于PCR+膜杂交法及实时荧光PCR熔解曲线法进行地贫检测，均能较好的满足试剂盒的检测要求。2种试剂盒都正常检测出临床上常见的各种地贫基因型。

综上所述，DBS标本对运输、保存要求较低，结合自动化血斑标本DNA提取，操作简单、提取结果稳定，有利于大范围开展地贫防控工作。

[1]Cao A, Galanello R. Beta-thalassemia. Genet Med,2010,12(2):61-76.

[2]Weatherall DJ. The inherited diseases of hemoglobin are an emerging global health burden. Blood,2010,115(22):4331-4336.

[3]Xiong F, Sun M, Zhang X, Cai R, Zhou Y, Lou J, Zeng L, Sun Q, Xiao Q, Shang X, Wei X, Zhang T, Chen P, Xu X. Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China. Clin Genet,2010,78(2):139-148.

[4]Xiong F, Huang QY, Chen XY, Zhou Y, Zhang X, Cai R, Chen Y, Xie J, Feng S, Wei X, Xiao Q, Zhang T, Luo S, Yang X, Hao Y, Qu Y, Li Q, Xu X. A melting curve analysis--based PCR assay for one-step genotyping of β-thalassemia mutations a multicenter validation. J Mol Diagn,2011,13(4):427-435.

[5]Saavedra-Matiz CA, Isabelle JT, Biski CK, Duva SJ, Sweeney ML, Parker AL, Young AJ, Diantonio LL, Krein LM, Nichols MJ, Caggana M. Cost-effective and scalable DNA extraction method from dried blood spots. Clin Chem,2013,59(7):1045-1051.

[6]严提珍，罗世强，唐宁，钟青燕，聂昌君，李伍高，王秋华，蔡稔. 实时荧光PCR熔解曲线法在β-地中海贫血基因诊断和产前诊断中的临床应用评价. 中华检验医学杂志,2012, 35(5):407-412.

[7]李广华，荣卡彬，罗燕飞，陈冬，龚彩平，吴劲，邸玉玮，葛艳芬.利用孕妇血浆中的胎儿DNA进行β-地中海贫血的产前诊断. 南方医科大学学报,2011,31(8):1437-1439.

AutomaticDNAextractionfromdriedbloodspotsonfilterpaperanditsapplicationinthediagnosisofthalassemia

HuangShuodan，ZhanWei，ZouJie，ZhuangYuchang,XiongRong,ZhuShasha,ZhangHuaneng,LuanGuoyan.

GeneticDiseasePreventionCenter,MeizhouMaternalandChildHealthHospital,Meizhou514012,China

ObjectiveTo study the method of automatic DNA extraction from dried blood spots (DBS) on filter pater and its application in the molecular diagnosis of thalassemia.MethodsPeripheral blood specimens were collected from 276 pregnant women who were diagnosed with thalassemia through molecular diagnostic procedures using venous blood samples. The 276 peripheral blood samples were used to prepare 240 standard DBS specimens, 18 DBS specimens with incomplete blood penetration, and 18 DBS specimens with repeated blood blotting, according to the study protocol. Different transportation and storage conditions were simulated. DNA was extracted from the DBS onto filter paper with the Lab-Aid 820 Nucleic Acid Extraction System. The concentration and purity of the extracted DNA were analyzed with consideration of the different initial amounts of blood used for the preparation of DBS. Fluorescence PCR melting curve analysis and the PCR-based reverse dot-blot method were then used to detect the gene mutations responsible for thalassemia in the patients.ResultsThe concentrations of the DNA extracted from the 276 DBS samples ranged from 9.85 ng/μl to 29.56 ng/μl, with a purity of 1.63～1.95, and met the requirements of the diagnostic kits. The results from the two genotyping methods were 100% consistent, and both methods detected gene mutations present in the common genotypes that are clinically associated with thalassemia, including IVS-Ⅱ-654 (C>T), -28 (A>G), CD17 (A>T), CD26 (G>A), CD41/42 (-TTCT), --αSEA, -α3.7, --α4.2, and αCSα. The genotyping results of the 276 DBS samples were completely consistent with the results from the assay in which DNA was directly extracted from venous blood samples.ConclusionsDBS specimens do not require stringent conditions for transportation and storage. Automatic nucleic acid extraction and purification from DBS samples provides a quick, simple, and reliable method and is suitable for clinical screening of the gene mutations associated with thalassemia.

Dried blood spot; Thalassemia; DNA extraction; Fluorescence PCR melting curve analysis

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.008

梅州市科技计划项目(2014B112)

514012 梅州，广东梅州市妇幼保健院遗传病防治中心(黄烁丹，邹婕，庄宇嫦，熊蓉)；361101 厦门，福建厦门致善生物科技有限公司研发部(占伟，朱莎莎，张华能，栾国彦)

2015-01-20) (本文编辑：林燕薇)