CRP+1444 C/T基因多态性与子宫内膜癌的相关性研究

王丽娟 巴音吉力 卢淮武 李晶 林仲秋

临床研究论著

CRP+1444 C/T基因多态性与子宫内膜癌的相关性研究

王丽娟 巴音吉力 卢淮武 李晶 林仲秋

目的探讨CRP+1444C/T基因多态性与子宫内膜癌(EC)的相关性。方法选择203例EC患者(EC组)和同期健康体检者203名(对照组)，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)方法检测CRP+1444C/T基因多态性，并结合血清超敏CRP(hsCRP)水平及其他临床资料进行分析。结果EC组的血清hsCRP高于对照组(P<0.05)，2组的CRP+1444C/T基因型和等位基因的分布相近，比较差异无统计学意义(P>0.05)。与子宫内膜癌BMI<25 kg/m2(正常)者相比， BMI≥25 kg/m2(超重)者CC基因型及C等位基因频率较高(P<0.05)；且超重者CC基因型组的hsCRP水平高于CT+TT基因型组(P<0.05)。结论CRP+1444C/T基因多态性可能和包括胰岛素抵抗以及炎症因子在内的某些机制共同作用，影响子宫内膜癌的发病风险。

C-反应蛋白；基因多态性；子宫内膜癌

子宫内膜癌(EC)的发生、发展与多种代谢异常有关，这些代谢异常与炎症之间关系密切[1]。CRP是一项敏感的反映机体炎症反应的标志物。目前认为，血清CRP水平是由生理因素和遗传因素相互作用、共同影响的结果。Carlson等(2005年)报道，CRP基因变异对血清CRP水平的影响占35%～50%。然而，目前关于CRP基因多态性与EC的相关性研究不多，中国汉族人群的资料更少。因此，本研究旨在探讨中国汉族CRP+1444C/T基因多态性分布及其与EC之间的关系。

对象与方法

一、研究对象

2011年3月至2014年10月在我院就诊的无血缘关系的203例汉族EC患者(EC组)，其EC均经手术病理活组织检查(活检)证实。以一对一选取年龄相匹配的203名汉族女性健康体检者为对照组。2组均排除合并其他恶性肿瘤或有家族性肿瘤病史者。

二、方法

1.采血及外周血DNA提取

研究组患者于入院后行体格检查并于次日清晨采集空腹血进行相关指标检测，对照组女性的数据为体检时获得。抽取入选者外周静脉血3 ml，以32 g/L柠檬酸钠抗凝，采用低渗破裂红细胞、标准蛋白酶K消化和饱和DNA试剂盒(北京天根公司)抽取外周血白细胞基因组DNA，-20℃保存。

2.CRP基因多态性分析

根据GenBank公布的CRP基因全序列设计引物，由Invitrogen生物工程有限公司合成。上游引物：5-AGCTCGTTAACTATGCTGGGGCA-3，下游引物：5-CTTCTCAGCTCTTGCCTTATGAGT-3，扩增的PCR产物为181 bp。PCR反应体系为25 μl，包括预制Taq混和物12.5 μl、Template DNA 1.5 μl、上下游引物各2 μl、灭菌蒸馏水7 μl。PCR反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。取PCR产物5 μl采用1%琼脂糖凝胶-溴乙锭染色法进行电泳，使用UVI自动凝胶成像及分析系统观察扩增结果。

3.PCR产物的限制性酶切

使用限制性内切酶HpyCH4Ⅲ对CRP+1444C/T位点的PCR扩增产物进行酶切。酶切体系为30 μl，包括PCR产物10 μl、HpyCH4Ⅲ内切酶1 μl，10倍FastDigest缓冲液2 μl，灭菌蒸馏水17 μl。于37℃孵育1～2 h，取10 μl经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像及分析系统判断基因型，取部分PCR扩增产物送广州艾基生物技术有限公司测序以进一步验证。

4.生化指标及体检资料

采用日立7600全自动生化分析仪测定甘油三酯、LDL-C、HDL-C、血糖和超敏CRP(hsCRP)。

三、统计学分析

结 果

一、EC组与对照组的一般资料及生化指标比较

EC组患者的腰围、BMI、收缩压、舒张压、甘油三酯、空腹血糖、hsCRP水平均高于对照组(P均<0.05)，HDL-C水平低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 EC组与对照组的一般资料和代谢特征资料比较

注：1 mm Hg=0.133 kPa

二、CRP基因+1444C/T多态性检测及PCR产物测序结果

PCR扩增产物为181bp的特异性片段(图1)，然后用内切酶HpyCH4Ⅲ酶切。本研究检测到3种基因型(图2)：TT纯合型(156 bp、25 bp)、CT杂合型(181 bp、156 bp和25 bp)和CC纯合型(181 bp)。PCR产物经测序进一步验证成功(图3)。

图1 CRP+1444位点PCR扩增电泳图M：DNA标记物

三、CRP基因+1444C/T多态性分布特点及与EC的关系

图2 RP+1444位点酶切电泳图1：CC基因型 2：CT基因型 3：TT基因型 M：DNA标记物

图3 CRP+1444基因部分序列及测序图箭头所指该点为C/T双峰，为CT基因型

CRP+1444C/T基因型频率分布经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。各基因型在EC组和对照组的分布比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；而TT基因型以及C等位基因频率在2组间的分布比较差异有统计学意义(P均<0.05)。经logistic回归分析，调整年龄、舒张压、收缩压、血糖、甘油三酯、LDL-C和HDL-C等多因素后显示，CRP+1444 C/T的CC、CT和TT基因型与EC均无关(P均>0.05)。将EC组按BMI分为BMI<25 kg/m2(正常)组和BMI≥25 kg/m2(超重)组，发现超重组CC基因型及C等位基因频率较正常组增高(χ2=4.011，P=0.045)，见表2。

表2 CRP+1444基因多态性分布

注：Pa表示EC组与对照组比较的P值;Pb表示2组经多因素分析校正后的P值；Pc表示EC两亚组比较的P值

四、CRP基因型与血清hsCRP水平的关系

EC组及对照组的CRP+1444 CC基因型组hsCRP水平与CT+TT基因型组比较差异无统计学意义(3.42vs. 3.61，t=0.155，P=0.877；1.94vs. 2.10，t=0.486，P=0.313)。EC的正常组与超重组hsCRP水平比较差异无统计学意义(3.25vs. 3.76，t=0.112，P=0.125)。EC的正常组(BMI<25 kg/m2)CC基因型与CT+TT基因型的hsCRP水平比较差异无统计学意义(3.28vs. 3.19，t=0.287，P=0.182)；而在EC的超重组，CC基因型组的hsCRP水平高于CT+TT基因型组(4.05vs. 3.12，t=2.196，P=0.038)。

对照组同样分为BMI<25 kg/m2的正常组和BMI≥25 kg/m2的超重组，2组的hsCRP水平比较差异无统计学意义(1.89vs. 1.97，t=0.528，P=0.438)。在BMI<25 kg/m2以及BMI≥25 kg/m2的对照组，CC基因型与CC+TT基因型的hsCRP水平比较差异均无统计学意义(1.93vs. 1.86，t=0.620，P=0.430；2.01vs. 1.92，t=0.910，P=0.340)。EC组的正常亚组hsCRP水平高于对照组的正常亚组(3.26vs. 1.89，t=9.589，P<0.001)。EC的超重亚组(BMI≥25 kg/m2)hsCRP水平高于对照组的超重亚组(3.76vs. 1.97，t=11.25，P<0.001)。

讨 论

目前大量研究表明，炎症在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用[2]。炎症标志物的表达量随着疾病严重程度的上升而增加，与相应受体结合后，可激活核因子-κB通路及JAK通路，促进细胞增殖、抗凋亡及促进肿瘤转移。处于慢性炎症状态时，患者的氧化应激水平提高，这也会为肿瘤提供适宜的微环境，利于肿瘤生长、转移。

CRP是炎症、感染和组织损伤急性期反应的非特异性标志物，是反映机体炎症状态的一种敏感、可靠的指标[3]。CRP基因定位于人类1号染色体q13.2区域，约跨越1.9 kb，含有2个外显子，中间由1个内含子隔开。功能学研究发现，CRP基因启动子-286C>T>A可影响转录因子的结合以及调节转录活性，已证实其为功能性多态性位点。CRP基因+1444C/T多态性与-286C>T>A多态性位点存在强的连锁不平衡。由此推测，CRP基因+1444C/T这种多态性变异可能影响转录的过程，也有可能其本身就影响启动子的活性，从而影响基础血清CRP水平。但是研究表明，CRP基础水平与很多因素相关，如性别、年龄、BMI、血脂、血压、环境因素、生活方式、遗传因素等，在各种因素所导致的个体CRP水平差异中，遗传因素所起的作用能够达到40%[4]。

目前关于CRP与EC的相关研究尚不多，Dossus等[5]研究发现，CRP明显升高的肥胖患者，发生EC的风险增高。既往研究表明，术前血清hsCRP水平与EC的FIGO分期、是否有淋巴结转移及患者年龄有关，高FIGO分期、淋巴结转移和年龄大于50岁者术前血清hsCRP水平明显增高；且hsCRP和肿瘤分期与EC的无复发生存期及总生存期密切相关，均可作为EC的独立预后因子[6]。

关于CRP基因多态性与EC的关系研究更少。在Wen等[7]的研究中发现，CRP+1444C/T在中心性肥胖的EC患者中存在基因型的差异，但未就其与EC患者相应的CRP浓度进行进一步的分析。本研究通过对CRP+1444C/T基因多态性与EC的相关分析，发现在EC患者和正常人之间，各基因型及等位基因分布频率比较差异无统计学意义。多因素分析显示，CRP+1444各基因型与EC无关。将EC组根据BMI分组后，发现超重组CC基因型频率较高，但2个亚组之间血清hsCRP水平比较差异无统计学意义。EC的超重亚组(BMI≥25 kg/m2)中，CC基因型组的hsCRP水平高于CT+TT基因型组。对照组不同BMI亚组之间以及同一BMI亚组不同基因型之间的hsCRP水平相近。相同BMI水平的EC组与对照组相比，hsCRP水平均为EC组高于对照组。这说明EC患者处于一种慢性炎症状态，并通过hsCRP水平反映出来，且基因型在一定程度上可以影响血清hsCRP水平。这些与Dossus等[5]研究结果相一致。

但在Marsik等(2006年)的研究报道中，携带CRP+1444 C等位基因者的基础血清CRP水平并不高，而IL-6水平较高；静脉给予2 ng/kg内毒素刺激后，表现为TNF-α和IL-6水平明显增高、体温上升，究其原因，可能携带CC基因型者炎症反应更强烈。笔者既往研究表明，随着BMI的增加，EC患者代谢综合征的发生率从低体重亚组的0增至肥胖亚组的100%，而代谢综合征是EC发病的独立危险因素[8]。肥胖和代谢综合征共同的通路是胰岛素抵抗，根据上述结果推测，CRP+1444 CC等位基因可能通过肥胖相关的炎症反应导致EC的发病风险增加，但其更深层的机制需要进一步研究。也有不尽一致的研究结果， Kumurcu-Bayrak等[9]的研究发现，在高血压病患者中，CRP+1444 CT+TT基因型与血清CRP水平升高有关。在Martinez-Calleja等[10]的研究中发现，合并肥胖的2型糖尿病患者CRP+1444 TT基因型占优势。肥胖、高血压病、糖尿病作为EC的3大危险因素，与CRP+1444的基因多态性结果却不一致，原因可能是EC的发生是多基因遗传因素与环境因素共同作用的结果，而单一基因、单一位点的作用较弱。

本研究虽然未直接发现CRP+1444基因多态性与EC的关系，但显示出了不同BMI者有不同的基因多态性分布，且EC患者超重亚组CC基因型组的hsCRP水平高于CT+TT基因型组。这提示我们CRP基因多态性可能和其他因素相互作用、相互影响，通过胰岛素抵抗和炎症因子的共同作用影响EC的发病。

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AssociationofC-reactiveproteingene+1444C/Tpolymorphismwithendometrialcancer

WangLijuan,Bayinjili,LuHuaiwu,LiJing,LinZhongqiu.

DepartmentofGynecologicalOncology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

,LinZhongqiu,E-mail:lin-zhongqiu@163.com

ObjectiveTo investigate the potential association between C-reactive protein (CRP) gene +1444 C/T polymorphism and endometrial cancer.MethodsIn this study, 203 patients with endometrial cancer (EC) and 203 healthy controls were enrolled into the EC and control groups. The CRP gene+1444 C/T polymorphism was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The serum hsCRP levels combined with alternative clinical data were determined for subsequent analysis.ResultsThe serum hsCRP level in the EC group was significantly higher compared with that in the control group (P<0.05). No statistical significance was documented in the frequencies of CC, CT and TT genotypes between two groups (P>0.05). Compared with EC patients with normal BMI (<25 kg/m2), a significantly higher frequency of CC genotype and C allele type was found in those with BMI≥25 kg/m2(P<0.05). In addition, women with CC genotype or C allele type had significantly higher serum hsCRP levels compared with those with CT and TT genotypes or T allele type (bothP<0.05).ConclusionCRP gene +1444 C/T polymorphism, insulin resistance and inflammatory factors may collectively affect the risk of EC.

C-reactive protein; Gene polymorphism; Endometrial cancer

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.006

广东省医学科研基金(B2012105)

510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院妇科肿瘤专科

，林仲秋， E-mail: lin-zhongqiu@163.com

2015-02-26) (本文编辑：林燕薇)