三丁基氯化锡对僧帽牡蛎淀粉酶和脂肪酶活性的影响

陈细香,2，吴文杰，刘雯霞

(1.福建泉州师范学院化学与生命科学学院，福建 泉州 362000；2.泉州师范学院分子生物与药物化学福建省高校重点实验室，福建 泉州 362000)

·生物工程·

三丁基氯化锡对僧帽牡蛎淀粉酶和脂肪酶活性的影响

陈细香1,2，吴文杰1，刘雯霞1

(1.福建泉州师范学院化学与生命科学学院，福建 泉州 362000；2.泉州师范学院分子生物与药物化学福建省高校重点实验室，福建 泉州 362000)

为研究三丁基氯化锡(TBTCL)对僧帽牡蛎消化酶活性的影响，将僧帽牡蛎分别在TBTCL质量浓度为0、2、5、10、50、100 ng·L-1的共6 组实验海水中培养4 d，以酶学分析的方法测定消化腺淀粉酶和脂肪酶活性。结果表明不同质量浓度TBTCL对僧帽牡蛎淀粉酶、脂肪酶活力的影响表现出不同的变化趋势：TBTCL对僧帽牡蛎消化腺淀粉酶活性总体呈显著抑制作用(P<0.05)，表现为从强到弱再强的抛物线趋势，在10 ng/L的质量浓度时TBTCL对淀粉酶活力的抑制作用最弱，呈显著的剂量-效应关系；各质量浓度TBTCL对脂肪酶活性具诱导效应，低质量浓度(2 ng·L-1,5 ng·L-1)诱导作用较强，随着质量浓度的升高，诱导作用减弱，呈显著的剂量-效应关系。

僧帽牡蛎；三丁基氯化锡；淀粉酶；脂肪酶；消化腺

有机锡化合物广泛应用于杀虫剂、海洋船舶的防污涂料，被认为是迄今为止人为引入海洋环境的毒性最大的化合物之一，对非靶生物有很强的毒害作用。由于其长期残留性，易于在海洋生物中蓄积，食用海产品可能存在遭TBT污染的潜在危险[1]。已经有大量研究证明了有机锡化合物对生物的生存、生长、发育、繁殖存在不良影响[2-5]，甚至环境中极低的有机锡含量(ng·L-1) 就会对生物产生严重的毒害作用[6-7]。目前我国海水遭到了严重的TBT污染，海水中污染水平从<0.5 ng·L-1到976.9 ng·L-1，污染比较严重的地方都集中在较大的港口、码头、船厂附近[8]。三丁基氯化锡(tributyltin chloride，TBTCL)是TBT在水中的主要存在形式，是一种高毒性化合物[9]。本文研究TBTCL对僧帽牡蛎(Ostreacucullata)消化酶(包括淀粉酶、脂肪酶)部分性质的影响，探讨将海洋双壳类酶活性等作为监测海洋锡污染的监测指标的可行性，为餐桌食品污染的防患、无公害水产品的生产提供指导。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

UV759紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、Centrifuge5415R冷冻离心机(德国Eppendorf)等。

1.1.2 试剂

海皇速溶海水晶(俗称海盐)、牛血清白蛋白(99%，上海生工生物工程有限公司产品)、考马斯亮蓝G-250(Fluka 产品)、三丁基氯化锡(98%，上海紫业化工有限公司)，其他试剂为国产分析纯试剂。

1.2 实验材料

实验采用健康牡蛎，购自泉州浔埔海鲜世界大型超市，体质量25.69～38.12 g，贝高2.29～2.78 cm，贝长6.29～7.34 cm。实验前将购买回来的牡蛎在实验室内暂养1周，待其状态稳定后选取大小一致、活力好的个体用于实验。

1.3 试验方法

1.3.1 染毒处理

TBTCL用无水乙醇溶解定容，配制 Sn 10 μg·L-1母液，备用，实验时稀释配制成所需质量浓度的试验液。空白对照组加相应量无水乙醇(控制在0.05 mL·L-1水)。实验用水由符合中国沿海海水成分研制的海盐溶解于双蒸水(经双道原子荧光光度法测定，总锡未测出)配制而成。实验期间水温23～25 ℃，盐度30～32。僧帽牡蛎放置于含60 L砂滤海水的养殖玻璃箱内，24 h充气，投饵。

根据环境部门规定的允许水平[10]及污染海域环境中有机锡质量浓度[11]，设置1个空白对照组和5个质量浓度梯度实验组，其质量浓度分别为0、2、5、10、50和100 ng·L-1，并且分别做3组平行实验。每24 h换水一次，同时添加污染物，使TBTCL暴露组质量浓度保持在设定质量浓度，染毒1、2、3和4 d后取样。

1.3.2 粗酶液提取

从实验组中分别随机取出牡蛎样品6只，去其外壳取出软组织，用蒸馏水冲洗其软体组织数次，冰浴下快速活体解剖，取出消化腺，并用滤纸拭干后称量，以8倍体积预冷磷酸缓冲液冰浴匀浆，4 ℃离心(12 000 r·min-1，30 min)，取上清液(即粗酶提取液)，置于-80 ℃冰箱中冷冻保存至待测。脂肪酶活性测定用的粗酶液不需离心。

1.3.3 蛋白质含量测定

粗酶提取液中蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定[12]。

1.3.4 酶活性测定

采用Bernfeld法[13]测定淀粉酶活性，采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法[14]测定脂肪酶活性。

1.4 数据处理

实验结果进行统计处理。数据结果以平均数±标准误(Mean±S.E.)表示。用方差分析方法分析TBTCL污染引起的差异；用Duncun’s 法对组间数据进行差异性显著分析，P<0.05 认为是差异显著，P<0.01认为是差异极显著；用双因素方差分析方法分析三丁基氯化锡TBTCL 剂量和时间交互作用的显著性。统计软件为SPSS 13.0 for Windows，作图软件为OriginPro7.5。

2 结果

2.1 三丁基氯化锡(TBTCL)对僧帽牡蛎淀粉酶活性的影响

在消化腺中，淀粉酶的活性与TBTCL质量浓度和处理时间存在着一定的时间剂量效应关系(表1，图1)。在对照组(0 ng·L-1)中，淀粉酶的活性在整个实验周期内没有显著变化(P>0.05)。在2、5、10、50、100 ng·L-1的各质量浓度三丁基氯化锡(TBTCL)胁迫下，僧帽牡蛎消化腺的淀粉酶活性均低于0 ng·L-1对照组，该5个实验质量浓度下的三丁基氯化锡(TBTCL)均起到抑制作用。在2 ng·L-1的低质量浓度下即表现出显著的抑制作用(P<0.05)，而后随TBTCL质量浓度的升高，淀粉酶活性升高，抑制作用减弱，在10 ng·L-1的质量浓度下，淀粉酶活性远远高于其他TBTCL质量浓度胁迫下的活性，但仍低于对照组，表现为不显著的抑制作用(P>0.05)。50 ng·L-1的TBTCL质量浓度胁迫下，淀粉酶活性开始呈下降趋势，抑制作用显著增强。在TBTCL不同质量浓度的胁迫下，僧帽牡蛎消化腺淀粉酶活性表现出先上升后下降的趋势，并呈现剂量-效应关系。2、5、10、50、100 ng·L-1的各染毒质量浓度下，1、2和3 d的抑制程度差异不显著(P>0.05)，但与4 d的抑制程度均有显著差异(P<0.05)。

表1 TBTCL对僧帽牡蛎淀粉酶活性的影响

注：同行数值上标大写字母不相同，表明差异显著(P<0.05)；同列数值上标小写字母不相同，表明差异显著(P<0.05)。

图1 三丁基氯化锡(TBTCL)对僧帽牡蛎淀粉酶活性影响的剂量-效应曲线

双因素方差分析(表2)表明，时间对帽牡蛎消化腺淀粉酶活性存在显著差异(P<0.05)，质量浓度对帽牡蛎消化腺淀粉酶活性存在极显著差异(P<0.01)，但质量浓度与时间交互作用不存在显著差异(P>0.05)。

表2 TBTCL对僧帽牡蛎淀粉酶活性影响的双因素方差分析表

2.2 三丁基氯化锡(TBTCL)对僧帽牡蛎脂肪酶酶活性的影响

由表3 可知，0 ng·L-1三丁基氯化锡污染下，实验周期内僧帽牡蛎消化腺内脂肪酶活性变化差异不显著(P>0.05)。在2、5、10、50 ng·L-1的各质量浓度的三丁基氯化锡(TBTCL)胁迫下，脂肪酶活性均高于0 ng·L-1对照组，均起到诱导作用；100 ng·L-1质量浓度组虽然在第1d时脂肪酶活性为9.99 U·mg-1，略低于对照组，但差异不显著，所以，整体趋势上也表现为诱导作用。1、2 和3 d内，5、10、50 ng·L-1染毒质量浓度下，三丁基氯化锡TBTCL的诱导程度均有显著差异(P<0.05)，第4 d脂肪酶活性显著下降，诱导效应减弱。

表3 TBTCL对僧帽牡蛎脂肪酶活性的影响

注：同行数值上标大写字母不相同，表明差异显著(P<0.05)；同列数值上标小写字母不相同，表明差异显著(P<0.05)。

由图2可知：实验周期内，2～100 ng·L-1的质量浓度内，三丁基氯化锡对僧帽牡蛎消化腺脂肪酶活性呈诱导作用，2 ng·L-1时增强率最大，为24.85%；但随TBTCL质量浓度增高，诱导效应减弱，增强率降低。脂肪酶酶活性存在剂量-效应关系。

图2 三丁基氯化锡(TBTCL)对僧帽牡

双因素方差分析(表4)表明，时间和质量浓度对帽牡蛎消化腺脂肪酶活性存在极显著差异(P<0.01)，但质量浓度与时间交互作用的差异不显著(P>0.05)。

表4 TBTCL对僧帽牡蛎脂肪酶活性影响的双因素方差分析表

3 讨论

消化酶是按酶的功能进行分类的诸多酶中的一种，具有酶的所有特征，而贝类消化酶活性是反映贝类动物消化生理机能的一项重要指标，与贝类生活的环境、食性有很大关系[15]。有研究表明在TBT污染下，对于贝类而言，其有机锡含量为外套膜>鳃>肝脏>解剖剩余物>消化道>肌肉，这说明TBT较易被吸附在肝脏中[16]。僧帽牡蛎营固着生活，滤食性，较MBT 和DBT 而言，TBT 更易吸附在水体悬浮颗粒物上[17]而被滤食性贝类所获取，通过血液循环进入消化腺中。僧帽牡蛎消化腺中包含肝组织，而肝是鱼贝类的的重要器官，它负责对消化酶的合成和分泌以及随后对营养物质的吸收，而且也影响排泄、生长繁殖周期、无机物质的贮藏和脂类、糖类代谢，从而引起消化酶的活性变化。

本研究中，TBTCL对僧帽牡蛎消化腺淀粉酶和脂肪酶活性呈现不同变化趋势。淀粉酶总体呈显著抑制作用(P<0.05) ，与大多数环境胁迫下体内生化酶的变化规律一致，脂肪酶的变化趋势则起诱导作用。

2007年，Blumberg等提出“环境致肥因子”的概念，并提出了第一批候选致肥因子，其中包括有机锡[18]。已有研究证实，TBT 可作为视黄类X 受体(retinoid X receptor，RXR)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的配体，干扰脂肪代谢[19-21]。在实验中，TBTCL对脂肪酶活性有很大影响，整体表现为诱导。脂肪酶是以脂肪为底物的一类消化酶，实验结果表明TBTCL胁迫后僧帽牡蛎对脂类的消化能力增强，预示TBTCL对僧帽牡蛎而言也是一种“环境致肥因子”。

本实验显示，三丁基氯化锡在2 ng·L-1时就能对僧帽牡蛎淀粉酶和脂肪酶活性起到较强的刺激作用，且浮游生物对有机锡有明显的富集作用，港口附近的浮游生物体内有机锡含量可达670～800 ng·g-1(干质量)[22]，远高于环境质量浓度。软体动物体内能够累积较高质量浓度的有机锡，例如贝类可以从环境中迅速吸收、富集有机锡，使体内有机锡含量达到22 ng·g-1(湿质量)，高于环境5 000～6万倍[23]，因此必须加强养殖海区水质检测和管理。此外，僧帽牡蛎全部营附着生活，比鱼类更适合作为局部海域环境污染监测生物。

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(编校：叶超)

EffectofTributyltinChlorideonAmylaseandLipaseActivityinOstreaCucullata

CHEN Xi-xiang1,2，WU Wen-jie1，LIU Wen-xia1

(1.SchoolofChemistry&LifeScience,QuanzhouNormalUniversity,Quanzhou362000China；2.KeyLaboratoryofMolecularBiologyandMediceinalchemistry,QuanzhouNormalUniversity,Quanzhou362000China)

To study the effect of tributyltin chloride on amylase and lipase activity in digestive gland,Ostreacucullatawere exposed to the tributyltin chloride of six different concentrations(0, 2 , 5, 10 , 50 and 100 ng·L-1). After treatment of 1,2,3 and 4 d, the specific activities of amylase and lipase in theO.cucullatawere analyzed by using enzyme analytical method respectively. It showed that (1) TBTCL had a marked inhibition effect on amylase activity in the digestive gland (P<0.05) and the variation showed a parabola trend. There was the least inhibition effect at 10 ng·L-1. It represented a dose-effect relationship. (2) In the different concentration of TBTCL, lipase activity was induced significantly (P<0.05). There was higher induction at lower concentrations(2 ng·L-1and 5 ng·L-1). The degree of induction by TBTCL decreased with the increase of TBTCL concentration. The phenomena above suggested that lipase activity was significantly related to the exposure dosage. Thus, it was deduced that the activity of amylase and lipase inO.cucullatashow different variation patterns under different concentrations of TBTCL.

Ostreacucullata；tributyltin chloride；amylase；lipase；digestive gland

2014-02-17

福建省科技厅青年科技人才创新项目(2008F3095)；福建省高校服务海西建设重点项目( A102) ；硕士学位授予单位立项建设学科(生物学)

陈细香(1972—)，女，副教授，博士，主要研究方向为环境生态学。

Q556; X17115

：A

：1673-159X(2015)01-0093-05

10.3969/j.issn.1673-159X.2015.01.017