黄曲霉毒素B1 对雏鸡外周血T 淋巴细胞亚群及 血清IL–2和IFN–γ 的影响

于正强，陈瑾，2，彭西*，方静，陈科杰，何杨

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 雅安 625014；2.西昌市畜牧局，四川 西昌 615000 )

黄曲霉毒素(aflatoxins，AFs)主要为黄曲霉菌及寄生曲霉菌产生的次生代谢产物[1–2]。AFs 对粮农产品的污染是全球面临的严重问题[3]。黄曲霉毒素B1(AFB1)急性中毒可引起动物急性肝损伤，严重者甚至死亡。有研究表明，摄食高含量的AFB1是造成肝癌的重要原因[4]。同时，摄食含AFB1的食物，可下调机体内多种免疫因子水平，进而降低其免疫功能[5]。AFs 对哺乳动物的免疫毒性主要表现为T 淋巴细胞增殖受阻、多种细胞因子水平下调[5]。外周血T淋巴细胞亚群是反映体内成熟T 淋巴细胞数量与功能的重要指标。目前，AFB1对雏鸡外周血T 淋巴细胞亚群、IL–2 和IFN–γ 的影响的报道甚少。本试验以1日龄艾维茵肉鸡为研究对象，探究梯度剂量的AFB1日粮对雏鸡外周血T 淋巴细胞亚群、IL–2 和IFN–γ 的影响，旨在为进一步探讨AFB1致免疫功能损伤的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试动物与日粮

试验选用1日龄艾维茵健康公雏鸡100 只，按初始体重无差异原则随机分为4组，每组25 只，分别采食基础日粮和AFB1Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组日粮。饲养管理与常规育雏一致，自由饮水与采食，试验期21 d。

AFB1日粮的配制方法为：分别将1.5、3、6mg AFB1粉末溶于30mL 甲醇中，再将30mL 溶液逐级掺入10 kg 基础日粮中，然后将掺有甲醇的日粮置于37℃烘箱中烘干，待甲醇挥发后取出。对照组日粮取30mL 甲醇混入10 kg 基础日粮后，以同样方法烘干。由此方法配制而成的对照组、AFB1Ⅰ、Ⅱ组、Ⅲ组日粮中，AFB1的含量分别为0、0.15、0.3、0.6mg/kg。

基础日粮以玉米–豆粕为主配制而成，其中蛋白质含量、能量以及维生素和微量元素添加量均参照肉鸡NRC(2004)的营养标准。基础日粮配方见表1。

表1 基础日粮配方及营养水平 Table 1 Composition of the experimental diets and nutrition level

1.2 外周血T 淋巴细胞亚群检测

试验第7、14 和21天，每组随机取5 只雏鸡，颈静脉抽取1mL 外周血，EDTA 二钠抗凝。取1mL淋巴细胞分离液于流式管中，将血液沿管壁徐徐加至淋巴细胞分离液之上，保持清晰的分层状态，随后2 000 r/min 离心30min。离心后可见试管内血液明显分为3 层，上层为血浆层，中层为分离液层，底层为红细胞层，用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出，收集到另一流式管中，PBS 洗2次后调节细胞浓度至1×106个/mL，吸取100 μL 细胞悬液于流式管中，加入CD4–FITC(SouthernBiotech, USA)、CD8–PE(SouthernBiotech, USA)和 CD3– SPRD(SouthernBiotech, USA)单克隆抗体，室温下避光反应30min，重悬细胞，流式细胞仪检测后用Cell Quest 软件分析 CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 细胞占外周血淋巴细胞的百分比，并计算CD3+CD4+T 与CD3+CD8+T 细胞的比值。

1.3 血清IL–2、IFN–γ 含量检测

试验第7、14 和21天，每组随机取5 只雏鸡，颈静脉采血，3 000 r/min 离心10min，分离血清，4℃保存，备用。用 ELISA 试剂盒检测 IL–2 (11R020，Rapidbio, USA)、IFN–γ(11R046, Rapidbio, USA)含量。

1.4 数据处理

数据均经SPSS16.0 统计软件进行统计。用单因素方差分析法分析试验组与对照组间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 外周血T 淋巴细胞亚群的变化

从表2 可以看出，与对照组比较，Ⅰ组外周血CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 细胞亚群所占百分比差异均没有统计学意义(P>0.05)；Ⅱ组和Ⅲ组外周血CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 细胞亚群所占百分比显著或极显著低于对照组(P<0.05 或P<0.01)，各组间的CD4+/CD8+比值差异没有统计学意义(P>0.05)。从流式象限图(图1)可以看出，随着日粮中黄曲霉毒素含量的增加，CD3+CD4+T 细胞和CD3+CD8+T 细胞数量逐渐减少。

表2 外周血T 淋巴细胞亚群百分比及CD4+/CD8+比率的变化 Table 2 Percentage change of the peripheral blood T-lymphocyte subsets and ratio of CD4+/CD8+

图1 21日龄雏鸡的T 淋巴细胞亚群流式象限图 Fig.1 The quadrantal diagram of T–lymphocyte subsets detected with flow cytometer method at 21 days of age

2.2 血清IL–2、IFN–γ 含量的变化

血清IL–2 检测结果(表3)显示，14日龄时，AFB1Ⅰ组IL–2 含量显著低于对照组(P<0.05)；7、14 和21日龄时，Ⅱ组IL–2 含量显著低于对照组(P<0.05)；7、14 和21日龄时，Ⅲ组IL–2 含量显著或极显著低于对照组(P<0.05 或P<0.01)。

表3 不同日龄雏鸡血清的IL–2 含量 Table 3 Changes of the serum IL–2 content with day of age

血清IFN–γ 检测结果(表4)显示，7日龄时，AFB1Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组IFN–γ 含量显著或极显著低于对照组(P<0.05 或P<0.01)；14日龄时血清IFN–γ 含量与对照组比较差异没有统计学意义(P>0.05)，但仍呈现降低趋势；21日龄时，AFB1Ⅱ、Ⅲ组IFN–γ含量显著低于对照组(P<0.05)。

表4 不同日龄雏鸡血清的IFN–γ 含量 Table 4 Changes of the serum IFN–γ content with day of age

3 结论与讨论

成熟T 淋巴细胞是机体细胞免疫的重要参与者，其生物学功能由表面的亚群结构决定。CD3 是成熟T 细胞的表面标志，CD4 和CD8 分别表达于不同的亚群之上，CD4+T细胞是辅助性T淋巴细胞，而CD8+T 细胞是毒性T 淋巴细胞，二者均能增强TCR/CD3 复合物结合抗原多肽或MHC 复合物的能力[6]。本试验结果表明，Ⅱ、Ⅲ组(AFB1含量分别为0.3、0.6mg/kg)外周血CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T 细胞所占百分比均显著降低，且此效应从7日龄持续到21日龄。Tomková 等[7]和Sabourin 等[8]研究表明，AFB1可明显降低小鼠外周血CD3+T 细胞；Heugten 等[9]和Raisuddin 等[10]分别对猪和小鼠摄食AFB1后免疫功能的研究表明，AFB1可抑制T、B 淋巴细胞的增殖。胸腺为雏鸡中枢免疫器官，是CD4+T 细胞和CD8+T 细胞活化和分化的场所，成熟T 细胞由胸腺转移到外周血和次级免疫器官[11]，因而T 细胞亚群的改变可反映机体胸腺功能的变化。AFB1可抑制淋巴细胞mRNA 的转录，同时影响DNA、RNA 的作用和蛋白质的生物合成[7,9,12]，扰乱细胞有丝分裂的物质准备。本试验结果外周血T 淋巴细胞亚群比例下降可能是AFB1抑制胸腺淋巴细胞增殖所致，这可能是引起成熟T 淋巴细胞减少的原因。此外，CD4+与CD8+的比值也是衡量机体免疫状态的指标。本试验中AFB1组外周血T 细胞中CD4+与CD8+的比值与对照组比较差异均没有统计学意义，可能是CD3+CD4+和CD3+CD8+T 细胞的比例同时下降的结果。

IL–2 主要是在促有丝分裂素或特异性抗原刺激下，由活化的CD4+Th1 细胞分泌，是T 淋巴细胞从G1期进入S 期的主要刺激因子[6]。IL–2 能促进T 细胞增殖，通过增加T 细胞数量，提高CD4+T细胞活性，以增强机体免疫功能，同时IL–2 可刺激活化的T 细胞产生干扰素，诱导T 细胞产生IL–2[13]。本试验结果显示，AFB1Ⅱ、Ⅲ组血清IL–2含量明显降低，与Dugyala 等[14]用AFB1处理CD–1小鼠，结果显示脾细胞IL–2 表达量及其mRNA 水平显著下降的结果一致。IL–2 表达量的减少可能是AFB1影响淋巴细胞内DNA 转录和mRNA 翻译，最终影响蛋白质的生物合成的结果[14–15]。本试验中同时检测到血清IL–2 含量的减少和CD4+T 淋巴细胞比例降低，这可能与CD4+T 淋巴细胞数量的减少，致其分泌的IL–2 减少，抑制了T 淋巴细胞的增殖有关[16]。Choi 等[17]用AFB1处理鼠脾脏培养细胞，结果细胞中IFN–γ 的表达量明显降低，AFB1能抑制IFN–γ 的表达并呈现出剂量依赖性，本研究结果与其一致。IFN–γ 是由活化的CD4+Th1 细胞分泌的一种细胞因子，IFN–γ 的表达可促进CD8+T 细胞的功能[18]，因而IFN–γ 的减少可能是由CD4+T淋巴细胞比例降低所致，同时IFN–γ 含量减少又会影响CD8+T 细胞的正常分化和增殖。在14日龄时，IFN–γ 水平与对照组相比呈下降趋势，但差异无统计学意义，这可能与不同个体对黄曲霉毒素的敏感性不同有关，也可能与机体通过稳态调节使各项机能接近正常有关[19]。

综上所述，雏鸡摄食含AFB1的日粮，可降低外周血T 淋巴细胞亚群数量及血清IL–2 和IFN–γ含量，进而导致其细胞免疫功能受损。

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