ELlSA法检测牛口蹄疫免疫非结构蛋白抗体的试验研究

才让吉

(青海省海南州同德县尕巴松多镇兽医站,青海海南 813299)

ELlSA法检测牛口蹄疫免疫非结构蛋白抗体的试验研究

才让吉

(青海省海南州同德县尕巴松多镇兽医站,青海海南 813299)

本实验采用间接ELISA方法检测牛口蹄疫病毒(FMDV)常规疫苗免疫牛的FMD抗体水平。实验采用引进的10头大通野血牦牛接种FND灭活疫苗15d 后抗体产生情况,确定了血清抗体产生效价的OD值,实际操作证明该方法简易、快速、灵敏度高。

FMD;非结构蛋白;ELISA;抗体检测

口蹄疫病毒（FMDV）的衣壳是20面的对称体，由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白构成，除结构蛋白外，FMDV还有几种非结构蛋白，包括前导蛋白酶2A、2B、2C、3A、3B、3C蛋白酶和3D聚合酶 及它们的前体（两种以上蛋白的复合体）。

采用疫苗的国家，大多数动物血清（FMDV）结构蛋白和病毒感染相关抗原（VIAA既3D）抗体为阳性，因此，一些基于结构蛋白和病毒相关抗原的诊断方法，很难确定FMDV感染与否，目前的疫苗生产工艺在病毒纯化过程中去除了大部分的非结构蛋白，因此用灭活苗免疫动物体内的抗体产生，而没有病毒非结构蛋白3ABC抗体产生，为此检测FNDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且以区分感染动物和免疫动物，并能及时了解免疫动物的抗体水平，有效预防动发生FDV具有非常重要的意义。

1 使用范围

FMDV非结构蛋白3ABC抗体检测ELISAKiT，检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体，不受血清型影响，适用于疫区净化检疫，群体无症状评价和口蹄疫疫病的诊断。

2 原理

接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验（I—ELISA）法用于测定抗体，用抗原将固相载体致敏，加入含有特异抗体的血清，经孵育一段时间后，固相载体表面的抗原和抗体形成复合物，洗涤除去其它成分，再加上酶标记的抗抗体，加入底物，在酶的催化作用下与底物发生反应，产生有色物质既可进行显色观察，现多用酶联免疫吸附试验检测仪，既酶标仪进行结果分析。

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 试剂

3ABC基因表达蛋白包被ELISA板、洗板封闭、阴阳性对照、如果血清中有3ABC抗体与ELISA板上3ABC蛋白结合，形成抗原—抗体复合物，再与酶标二抗结合，加入底A、B、终止液。

3.1.2 疫苗

FMD采用牛口蹄疫灭活疫苗，由中国威特生物科技股份有限公司生产的，批号为D10112J。

3.1.3 试验免疫动物

选用青海省大通县引进的10头野血牦牛进行FDV灭活疫苗肌肉注射，每头注射3ml，在首次免疫15d后采取V采血，制备血清，进行FDN抗体检测。

3.2 操作程序

（1）（PBST）用无离子水或蒸馏水做1：25倍稀释

（2）待检血清样品和阴阳性对照血清用稀释液1：21倍稀释，（120µl血清稀释液加血清6µl）每孔加入100µl阴阳对照血清样品平行加两孔，用封口膜封口，37℃结合30min。

（3）取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。

（4）用血清稀释液按1：100比例稀释酶标二抗，每孔加入100µl，用封口膜37℃ 结合30min。

（5）取掉封口膜，每孔加满洗涤液洗涤5次，最后一次拍干。

（6）将底物溶液A按1：50比例稀释于底物溶液B（1ml底物B中加入20µl底物 A）混匀，每孔加入100µl，用封口膜封口，37℃避光作用不超过10min。

（7）每孔加入100µl终止液，注意要按加酶标二抗的顺序加入终止液，应用酶标仪492nm波长测定吸光值（OD492值）。

4 结果判定

本试验检测了10份接种灭活疫苗15d的牛血清，其NSP—ELISA平均OD492nm值为0.3805，标准差为0.0685，临界值=0.3805+0.0685×3=0.5860。有8份血清OD492nm值 超出临界值，表明该I—ELISA对灭活疫苗免疫牛的特异性为96%以上。

5 结论

从上述计算中可以看到，免疫后15天抗体效价超出临界值的牛血清有8份，免疫效果理想，抗体效价弱的只有两头。灭活疫苗免疫牛血清非结构蛋白3ABC抗体的检测结果表明，本次试验建立的FMD—3ABC—I—ELISA不但能鉴别免疫动物抗体消长情况，而且对非结构蛋白中的3A、3B、3C对自然感染抗体也具有重大的意义，虽然本次试验血清份量少，但与上述计算结果完全吻合。

吸光度报告

图1 96孔酶标板检测10份牛免疫血清样品布局图

[1] 排合尔丁·穆太力甫，李建玲，马正海. 乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-Ⅰ型双价灭活疫苗免疫效果的检测与分析[J].安徽农业科学，2014，（27）：9400-9401.