利用残次红枣生产风味型酵母味素的工艺研究

李艺伟，张宝善，董婷婷,王 玮，李亚武，魏 冉

(1 陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062；2 陕西省果蔬深加工技术研究中心，陕西 西安 710062)

利用残次红枣生产风味型酵母味素的工艺研究

李艺伟，张宝善，董婷婷,王 玮，李亚武，魏 冉

(1 陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062；2 陕西省果蔬深加工技术研究中心，陕西 西安 710062)

【目的】 以残次红枣为原料，对利用红枣汁培养可食性酵母菌生产作为食品调味剂的风味型酵母味素的工艺技术进行研究，为提高残次红枣加工利用率提供新思路。【方法】 采用正交试验，分别对酵母菌在红枣汁中的增殖条件和营养因子对酵母菌增殖的影响进行优化；并以时间、温度、复合糖添加量和含硫化合物添加量为单因素，探讨制备风味型酵母味素的加工方法。【结果】 以红枣汁作为培养基，啤酒酵母菌产蛋白质的能力高于产朊假丝酵母菌和热带假丝酵母菌，其最适增殖条件为：红枣汁可溶性固形物含量150 g/kg、接种量40 mL/L、培养温度32 ℃、时间50 h、摇床转速190 r/min，NH4H2PO4、NaHSO3、MgSO4等营养因子添加量分别为0.03 mol/L、0.4 g/L和0.4 g/L。风味型酵母味素加工方法为：在质量分数20%的啤酒酵母抽提物混合液中按25 g/kg添加复合还原糖、按15 g/kg添加含硫化合物，于110 ℃下加热60 min。【结论】 本试验的风味型酵母味素制备工艺操作简便、适合工厂化生产，还可提高残次红枣的利用率，并可为市场提供新型食品调味料。

残次红枣；酵母菌；酵母味素；生产工艺

红枣(ZiziphusjujubaMill)俗名大枣，栽培历史悠久，营养丰富，自古以来被列为“五果”之一。红枣肉多味甘，含有糖类、有机酸、维生素和微量元素等营养成分，其糖类物质和维生素含量均高于其他水果。近年来，由于红枣良好的经济和生态效益，我国枣树栽培面积迅速扩大，红枣产量剧增，每年都有大量的红枣不能及时销售而剩余，尤其是残次红枣。残次红枣一般指无霉变但果个小、碰伤、裂果、成熟度低等果实，由于销售困难而造成浪费。因此，研究剩余红枣及残次红枣的深加工技术显得日益重要和迫切[1-6]。

酵母味素是可食性酵母菌细胞的水解产物。单细胞酵母菌富含核酸、蛋白质、肽等呈味物质，菌体通过细胞自溶或水解等方法可使其核酸水解为呈味核苷酸，蛋白质水解为有鲜味的肽和氨基酸。因此，酵母味素是一种营养功能型调味剂，具有增香、增鲜以及赋予食品醇厚感等作用。目前酵母味素的加工与利用主要在欧美等国及日本，在鲜味剂市场的占有率约37%[7]，生产用的材料大多是啤酒或酒精发酵时的酵母泥，原料相对短缺。研究发现，红枣富含糖及其他营养物质，用其制作的红枣汁是培养酵母菌的极好天然培养基[8]。为此，本试验以残、次红枣为原料，研究用红枣汁生产酵母味素的工艺及技术，以期提高残次红枣的加工利用率，为人类提供健康安全的食品调味剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

残次红枣，市场一次性购买，为未腐烂变质的残次果；啤酒酵母菌(Sacccharomycescerevisiae)，陕西师范大学食品发酵实验室保存；产朊假丝酵母菌(Candidautilis)和热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)，购于陕西省微生物研究所。

LGJ-18C真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；Kjeltec2300全自动凯氏定氮仪，瑞典福斯公司；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本HITACHI公司；DL-4C低速大容量离心机和RE-52旋转式蒸发器，上海安亭实验仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用公司；SCP-9080MBE隔水式恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HHW-21CU-600电热恒温水槽，上海福玛实验设备有限公司；PHS-3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司；THZ-C恒温振荡器，江苏太仓市试验设备厂；SW-CJ-1F超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；手持糖度计，上海光学精密仪器厂；ME21(MSHOT)数码生物显微镜，广州明美科技有限公司。

1.2 测定指标及测定方法

1.2.1 可溶性固形物含量(SSC) 采用手持糖度计测定。

1.2.2 粗蛋白 按GB/T 5511-2008凯氏定氮法进行测定。

1.2.3 活菌数 采用平板计数法测定。

1.2.4 氨基酸态氮 采用甲醛滴定法测定。

1.2.5 氨基酸含量 利用全自动氨基酸分析仪测定。柱子为4.6 mm×60 mm的2622阳离子交换树脂填充柱；分离柱温57 ℃；反应柱温135 ℃；柱压4.4 MPa；N2压力0.11 MPa；缓冲液流速0.4 μL/min，茚三酮溶液流速0.35 μL/min，缓冲液改变7次；氨基酸混合液为P/N855-5993；进样量20 μL(样品)，2 nmol/μL(标准量)；分析时间53 min。

1.2.6 香气评定 采用感官评价。选出20名具有相关专业知识的健康评价人员，用任意词汇对每个样品的风味进行完整的定性描述，根据每个词汇的使用频率，选取使用频率最高的词汇作为最终评价结果。

1.2.7 美拉德反应前后氨基酸态氮损失率 将美拉德反应前后的溶液于4 000 r/min离心20 min，取上清液，利用甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量。按下式计算氨基酸态氮损失率：

式中反应前氨基酸态氮含量包括添加的半胱氨酸含量。

1.3 风味型酵母味素的生产工艺流程及操作要点

1.3.1 生产工艺流程 风味型酵母味素的生产工艺流程为：

种子液←扩大培养←菌种选择

↓

红枣汁→酵母菌增殖→菌体收集→水洗→破壁→灭酶

↓

风味型酵母味素←酵母抽提物←冷冻干燥←菌体分离

1.3.2 操作要点 (1)红枣汁提取。将试验所用的所有残次红枣清洗干净，用粉碎机破碎。向破碎红枣中加入其质量6倍的水，于95～100 ℃浸提1 h，分离红枣汁；再向红枣渣中加入原红枣质量3倍的水，95～100 ℃热处理30 min，得二次提取汁；将2次提取的红枣汁合并，用孔径75 μm筛过滤，得SSC 为40～50 g/kg的红枣汁。利用旋转蒸发仪在真空度为0.08～0.09 MPa下浓缩红枣汁[9-12]，冷藏供后续试验用。

(2)酵母菌增殖。将啤酒酵母菌、产朊假丝酵母菌和热带假丝酵母菌3种菌种分别接种于含100 g/kg SSC的麦芽汁固态斜面培养基中，30 ℃下活化24 h。将活化好的菌种分别转接到100 mL含100 g/kg SSC的红枣汁中，在30 ℃下培养24 h得种子液，以用平板计数法测得酵母菌密度达到108CFU/mL为宜。再将发酵种子液接种到添加营养因子的红枣汁中，32 ℃下增殖培养。

(3)菌体收集。增殖结束的发酵液用离心机于5 000 r/min离心20 min，即得酵母菌泥，再将酵母菌泥与无菌水混合，无菌水加入量为酵母菌泥质量的10倍，水洗处理重复2次，收集酵母菌体[13]。

(4)菌体破壁。采用自溶法进行破壁处理，加水量为酵母泥质量的2倍，初始pH 5.5，按35 g/kg加入NaCl，于50 ℃下自溶50 h。破壁处理结束后将酵母菌水解升温至85～90 ℃，保温15 min，进行酶钝化[14-17]。

(5)不溶物分离。将上述水解液用离心机在转速6 000 r/min下离心30 min，除去细胞壁与不溶物。

(6)风味型酵母味素制备。在质量分数20%的啤酒酵母抽提物混合液中按25 g/kg添加复合还原糖(m(葡萄糖)∶m(木糖)=4∶1)，按15 g/kg添加含硫化合物(m(半胱氨酸)∶m(硫胺素)=2∶1)，于110 ℃下加热60 min，即得风味型酵母味素。

1.4 酵母菌增殖试验

1.4.1 酵母菌菌种的选择 将50 mL SSC 为100 g/kg的红枣汁装入三角瓶中，pH保持自然，分别接入热带假丝酵母菌、产朊假丝酵母菌和啤酒酵母菌，接种量为30 mL/L，在摇床转速为160 r/min下振荡培养50 h，产朊假丝酵母菌的培养温度为25 ℃，啤酒酵母菌和热带假丝酵母菌的培养温度为30 ℃。分离菌体测定粗蛋白含量。

1.4.2 酵母菌增殖条件的优化 依据前期单因素试验结果，以红枣汁中SSC含量、培养温度、红枣汁pH、接种量和摇床转速为因素，各因素取5个水平，即红枣汁SSC含量分别为50，100，150，200，250 g/kg，培养温度分别为26，28，30，32，34 ℃，红枣汁pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，菌种接种量分别为10，20，30，40，50 mL/L，摇床转速分别为130，160，190，220，250 r/min，选用L25(56)正交试验表进行试验，培养50 h后筛选出最佳培养液。以粗蛋白含量作为检测指标，确定啤酒酵母菌在红枣汁中增殖的最优条件。

1.4.3 营养因子的优化 以NH4H2PO4、NaHSO3、MgSO4的添加量为因素，选取前期单因素试验确定的各因素中的3个最优水平，即NH4H2PO4的添加量分别为0.02，0.03，0.04 mol/L，NaHSO3的添加量分别为0.3，0.4，0.5 g/L，MgSO4的添加量分别为0.3，0.4，0.5 g/L，选用L9(34)正交试验表进行试验，筛选出营养因子的最佳添加量。以粗蛋白含量作为检测指标，确定啤酒酵母菌在红枣汁中增殖时添加营养因子的最优组合。

1.5 风味型酵母味素的制备

1.5.1 反应时间对制备风味型酵母味素的影响 按体系总量配制质量分数为20%的酵母抽提物混合液，按25 g/kg添加复合还原糖(m(葡萄糖)∶m(木糖)=4∶1)，按照20 g/kg添加含硫化合物(m(半胱氨酸)∶m(硫胺素)=2∶1)，于110 ℃下分别反应30，45，60，75和90 min，即得风味型酵母味素，通过测定反应后氨基酸态氮损失率和香气评定结果，确定最佳反应时间。

1.5.2 反应温度对制备风味型酵母味素的影响 其他条件同1.5.1，将上述酵母抽提物混合液分别在90，100，110，120和130 ℃下反应60 min，即得风味型酵母味素。通过测定反应后氨基酸态氮损失率和香气评定结果确定最佳反应温度。

1.5.3 复合糖添加量对制备风味型酵母味素的影响 其他条件同1.5.1，在质量分数为20%的酵母抽提物混合液中分别添加10，15，20，25 和30 g/kg的复合还原糖，于110 ℃下反应60 min，即得风味型酵母味素，通过测定反应前后氨基酸态氮损失率和香气评价结果确定复合还原糖的最适添加量。

1.5.4 含硫化合物添加量对制备风味型酵母味素的影响 其他条件同1.5.1，在质量分数为20%的酵母抽提物混合液中按添加25 g/kg的复合还原糖，再分别添加10，15，20，25 和30 g/kg的含硫化合物，于110 ℃下反应60 min即得风味型酵母味素，通过测定反应后氨基酸态氮损失率和香气评定结果确定含硫化合物的最适添加量。

1.6 数据处理

测定和分析结果采用DPS 7.05和Excel进行处理。

2 结果与分析

2.1 酵母菌菌种的选择

以红枣汁为培养基时，培养50 h后不同酵母菌产蛋白能力见图1。从图1可知，啤酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的产蛋白能力高于热带假丝酵母菌，且啤酒酵母菌的产蛋白能力最强，高达2.60 g/L。因此，本试验选用啤酒酵母菌作为生产菌株。

图1 红枣汁中不同酵母菌种产蛋白能力的比较Fig.1 Comparison of protein producing ability of different yeasts in jajube juice

2.2 酵母菌增殖条件的优化

以红枣汁SSC含量、培养温度、红枣汁pH、接种量和摇床转速为试验因素，以粗蛋白含量作为检测指标，用L25(56)正交试验对酵母菌增殖条件进行优化试验，筛选出最佳培养液，确定啤酒酵母菌在红枣汁中增殖的最优条件。所得正交试验结果见表1，其方差分析结果见表2。

表1 红枣汁中酵母菌增殖条件优化的L25(56)正交试验结果Table 1 L25(56) orthogonal test results for optimizing the proliferation conditions of yeasts in jujube juice

续表1 Continued table 1

表2 红枣汁中酵母菌增殖条件优化的L25(56)正交试验结果的方差分析Table 2 Variance analysis of L25(56) orthogonal test results on optimizing the proliferation conditions of yeasts in jujube juice

注：**.差异极显著(P<0.01)；*.差异显著(P<0.05)。表4同。

Note:**.Extremely significant difference (P<0.01)；*.Significant difference (P<0.05).The same for Table 4.

由表1可知，啤酒酵母菌的最佳增殖条件为A3B4C2D4E3，即红枣汁可溶性固形物含量为150 g/kg，温度32 ℃，红枣汁pH 4.5(保持自然即可)，接种量40 mL/L，摇床转速190 r/min。在该条件下进行验证试验，测得啤酒酵母菌中的粗蛋白含量为3.60 g/L，高于正交试验结果(表1)中的最大值3.50 g/L。表2结果表明，红枣汁SSC和接种量对酵母菌的增殖效果影响极显著，摇床转速对其影响显著，温度和红枣汁pH对其影响不显著。

2.3 营养因子的优化

以NH4H2PO4、NaHSO3、MgSO4的添加量为因素，以粗蛋白含量作为检测指标，选用L9(34)正交试验进行酵母菌增殖营养因子的优化，并确定啤酒酵母菌在红枣汁中增殖时营养因子的最优添加量。在设定条件下，得到营养因子添加量的L9(34)正交试验结果见表3，其方差分析结果如表4所示。

表3 红枣汁中酵母菌增殖营养因子优化的L9(34)正交试验结果Table 3 L9(34) orthogonal test results for optimizing the trophic factors for yeast proliferation in jujube juice

续表3 Continued table 3

表4 酵母菌增殖营养因子优化的L9(34)正交试验结果的方差分析Table 4 Variance analysis of L9(34) orthogonal test results on optimizing the trophic factors for yeast proliferation

由表3可知，红枣汁中营养因子的最佳添加量组合为A2B2C2，即NH4H2PO4、NaHSO3和MgSO4的最适添加量分别为 0.03 mol/L、0.4 g/L和0.4 g/L。在该条件下进行验证试验，测得啤酒酵母菌粗蛋白含量达6.11 g/L，高于正交试验结果(表3)中的最大值6.02 g/L。表4结果表明，红枣汁中添加NH4H2PO4对酵母菌的增殖效果影响极显著，添加NaHSO3对其影响显著，添加MgSO4对其影响不显著。

2.4 风味型酵母味素的制备

2.4.1 反应时间对风味型酵母味素的影响 将添加复合还原糖和含硫化合物的啤酒酵母抽提物混合液进行美拉德反应，反应时间对氨基酸态氮损失率的影响见图2。从图2可知，氨基酸态氮损失率随着反应时间的延长而增大，并且呈前期逐渐上升而后期趋于平缓的趋势。在反应的前60 min内，混合溶液中的氨基酸随反应时间延长逐步发生反应并逐渐出现烤肉香味，反应60 min时氨基酸态氮损失率达到最大值，同时烤肉香味也最柔和，60 min之后氨基酸态氮损失率变化不明显，且伴随有焦味。说明美拉德反应进行到60 min时，氨基酸的利用达到最大且较为充分地转化为风味物质。综合分析认为，美拉德反应时间以60 min为宜。

2.4.2 反应温度对风味型酵母味素的影响 在啤酒酵母抽提物混合液中添加复合还原糖和含硫化合物，于不同温度下进行美拉德反应，测得反应后氨基酸态氮损失率如图3所示。由图3可知，随着反应温度的升高，混合液的氨基酸态氮损失率呈现上升趋势，反应温度低于110 ℃时，氨基酸态氮的损失率变化较平缓，烤肉香味逐渐明显；高于110 ℃后，氨基酸态氮的损失率变化程度加剧并伴有焦味。综合分析认为，美拉德反应的最适反应温度为110 ℃。

图2 反应时间对氨基酸态氮损失率的影响Fig.2 Effect of time on losing rate of amino acid nitrogen

2.4.3 复合糖添加量对风味型酵母味素的影响 在啤酒酵母抽提物混合液中添加含硫化合物和不同量的复合糖进行美拉德反应，测得反应后氨基酸态氮损失率如图4所示。由图4可知，随着复合糖添加量的增加，氨基酸态氮损失率呈上升趋势，烤肉香味逐渐明显并趋于柔和；当其添加量高于25 g/kg后，氨基酸态氮损失率虽仍上升，但速率明显放缓，同时开始产生焦味并趋于明显。说明适量的复合还原糖可消耗氨基酸及氨基化合物，从而促进反应的进行，复合糖若过量则会因为过度的焦糖化反应致使产物有焦味产生。综合分析认为，复合还原糖的适宜添加量为25 g/kg。

2.4.4 含硫化合物添加量对风味型酵母味素的影响 在啤酒酵母抽提物混合液中添加复合糖和不同量的含硫化合物进行美拉德反应，测得反应后氨基酸态氮损失率如图5所示。从图5可知，随着含硫化合物添加量的增加，氨基酸态氮损失率先缓慢增加，当添加量为15 g/kg时，氨基酸态氮损失率最高，之后随着其添加量的继续增加，氨基酸态氮的损失率又呈下降趋势。同时经感官测评，随着含硫化合物的适当增加，烤肉香味逐渐增强，但超过15 g/kg 后，硫化物的气味加重，掩盖了反应产物的烤肉香气，致使产品的风味质量下降。综合考虑认为，含硫化合物的最佳添加量为15 g/kg。

图4 复合糖添加量对氨基酸态氮损失率的影响Fig.4 Effect of content of complex sugars on losing rate of amino acid nitrogen

2.5 风味型酵母味素氨基酸含量的测定

试验所制备的风味型酵母味素为褐色液浆，表面无可见杂质，具有该产品特有的烤肉香味。经测定，其水分含量为601 g/kg、pH为5.7、氯化钠含量为184 g/kg，并含有丰富的氨基酸，各种氨基酸的含量见表5。

表5 风味型酵母味素中的氨基酸成分及其含量Table 5 Types and contents of amino acids in flavored yeast extract

3 讨论与结论

选定产蛋白质能力最强的啤酒酵母菌为本试验的最佳菌种，其增殖工艺参数为：在可溶性固形物含量为150 g/kg的红枣汁中，按体积比40 mL/L接入啤酒酵母菌种子液，并添加0.03 mol/L NH4H2PO4、0.4 g/L NaHSO3、0.4 g/L MgSO4等营养因子，保持pH自然，于32 ℃下用转速190 r/min 的摇床振荡培养50 h。以上述条件下获得的酵母菌为原料，采用自溶法进行破壁，在质量分数20%的啤酒酵母抽提物混合液中，按25 g/kg添加复合还原糖(m(葡萄糖)∶m(木糖)=4∶1)、按15 g/kg添加含硫化合物(m(半胱氨酸)∶m(硫胺素)=2∶1)，于110 ℃下加热60 min，即可获得风味型酵母味素。

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Production process of flavored yeast extract from inferior jujube

LI Yi-wei,ZHANG Bao-shan,DONG Ting-ting, WANG Wei,LI Ya-wu,WEI-Ran

(1CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an，Shaanxi710062,China;2ResearchCenterofFruitandVegetableDeep-processingTechnology,Xi’an,Shaanxi710062,China)

【Objective】 The experiment aimed to study the process of edible yeast cultured in jujube juice from inferior jujube and produce yeast extract as food flavoring agent,which can increase the utilization of inferior jujube.【Method】 The proliferation conditions of yeast in jujube juice and the effect of trophic factors were studied by orthogonal experiment,and the processing method of yeast extract was probed by single factor test of time,temperature,and contents of complex sugars and sulfur compounds.【Result】 The protein producing ability ofSacccharomycescerevisiaecultured by jujube juice was higher thanCandidautilisandCandidatropicalis.The optimum proliferation conditions ofS.cerevisiaewere:inoculating 40 mL/L yeast,SSC 150 g/kg,shaking speed 190 r/min,culturing time 50 h,and culturing temperature 32 ℃.The optimum amounts of NH4H2PO4,NaHSO3and MgSO4were 0.03 mol/L,0.4 g/L,and 0.4 g/L,respectively.Processing conditions for flavored yeast extract were:mass ratio of yeast extract 20%,complex sugars content 25 g/kg,content of sulfur compounds 15 g/kg,time 60 min,and temperature 110 ℃.【Conclusion】 The processing method of flavored yeast extract was easy to operate and suitable for industrialization.It also increased the utilization of inferior jujube and provided new food flavoring agent.

inferior jujube;yeast;yeast extract;processing method

2013-11-19

陕西省教育厅科学技术研究发展计划项目(12JK0818)

李艺伟(1990-)， 女，山西晋城人，在读硕士，主要从事食品发酵研究。E-mail：1045194168@qq.com

张宝善(1968-)， 男，甘肃张掖人，教授，硕士研究生导师，主要从事食品微生物和发酵工程研究。 E-mail：baoshan2@snnu.edu.c

时间:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.013

TS264.9

A

1671-9387(2015)04-0163-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.013.html