木蹄层孔菌乙醇提取物对小鼠肝脏和免疫细胞功能的影响

赵彦禹，张志敏，吴明松，王 哲，李学英

（遵义医学院医学遗传学教研室，贵州遵义563099）

木蹄层孔菌乙醇提取物对小鼠肝脏和免疫细胞功能的影响

赵彦禹，张志敏，吴明松，王 哲，李学英

（遵义医学院医学遗传学教研室，贵州遵义563099）

目的 研究木蹄层孔菌乙醇提取物对小鼠肝脏和免疫细胞功能的影响。方法 对小鼠口服灌胃低、中、高剂量（100、250、500 mg/kg）提取物，重复给药试验14 d，分别测定肝脏内丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活力、脾脏淋巴细胞增殖能力、腹腔巨噬细胞吞噬能力和脾脏自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤活性的变化。结果 不同药物剂量组小鼠ALT和AST活力与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同药物剂量组均能显著刺激脾脏淋巴细胞增殖，对NK细胞的杀伤活性无显著影响。高药物剂量组[500 mg/（kg·d）]能显著增加吞噬细胞的吞噬能力。结论 口服灌胃木蹄层孔菌乙醇提取物对实验动物肝脏无明显毒性，对其免疫系统无损害，并有促进个体淋巴细胞增殖的能力。

抗肿瘤药（中药）； 肝/损伤； 乙醇； 小鼠； 木蹄层孔菌； 免疫调节

药用菌菇类用于治疗疾病已有很长历史，尤其是在中国、印度、日本和韩国[1-2]。在肠胃疾病、各种癌症、支气管哮喘和盗汗治疗方面，这些传统的中药发挥着重要作用。但是，大部分中药的使用方法均为民间流传，对其带来的不利于健康的影响注意不够。世界卫生组织建议，在使用传统草药治疗疾病时要同时注意其带来的不良反应。

许多的多孔菌长期以来一直作为草药应用于各种疾病[3]。例如，灵芝、硫黄菌、云芝、猪苓、桦褐孔菌和茯苓等。木蹄层孔菌是多孔菌的一种，已证明其具有医学应用价值。在18～19世纪，木蹄层孔菌被用于止血敷料和包扎绷带[4]。药理学研究发现，这种草药含有多种生物活性物质[5-9]。但就木蹄层孔菌提取物亚急性暴露后，对肝脏和免疫功能的影响的研究甚少。本实验拟研究该提取物对小鼠肝脏和免疫细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 木蹄层孔菌乙醇提取物 将木蹄层孔菌子实体刷净，冲洗，晾干，粉碎，用95%乙醇在45℃浸泡提取，同时，用超声辅助提取，每次30 min。提取液滤纸过滤后真空浓缩，冷冻干燥获得乙醇提取物。冷冻干燥后的提取物预先溶解于乙醇，用1%阿拉伯胶制备成混悬液，最终含乙醇量不超过1%。

1.1.2 实验动物 实验动物均为昆明小鼠，雌性，6～8周龄，体质量18～22 g，购于第四军医大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 实验动物处理 将48只小鼠随机分成A、B、C、D组，每组12只。A组：空白对照组，口服灌胃双蒸水；B组：口服灌胃木蹄层孔菌乙醇提取物，每天100 mg/kg；C组：口服灌胃该提取物，每天250mg/kg；D组：口服灌胃该提取物，每天500 mg/kg。药物剂量的选择参照以往研究[10]。

1.2.2 肝脏毒性评价 服用药物2周后，所有小鼠空腹1夜，第2天摘取眼球取血。血样室温静置后，3 000 r/min离心15 min，取血清，随后进行肝脏内丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活力测定，研究服用提取物后是否改变了2种酶的活力，从而影响了肝脏的正常功能。ALT和AST测定试剂盒购自南京建成生物公司。

1.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力测定 服用药物2周后，所有小鼠空腹1夜，第2天常规取小鼠脾脏[15]，制备空白对照组，低、中、高剂量药物组的脾脏淋巴细胞悬液。将各组细胞悬液分别加入conA（终质量浓度5μg/mL），加样96孔板，每孔100 μL，每组设5个重复（n=5），将细胞板放入37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后取出，向每孔中加入20 μL噻唑蓝（MTT）液，继续培养4 h后取出，加入三联液（10%SDS，5%异丁醇，0.01 mol/L Hcl）（每孔100 μL），酶标仪检测吸光度值（OD值），作为淋巴细胞增殖的指标。测定波长为570nm，校正波长为630 nm，以溶液对照组的OD值为空白对照调零，实验重复3次。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力测定 取上述药物处理小鼠的腹腔巨噬细胞，将细胞接种于 96孔板，贴壁后孵育24 h，弃上清液，加入0.75 g/L中性红溶液每孔200 μL，置于37℃、5%CO2孵箱培养20 min后弃去上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗板 3次以上，除去细胞外中性红。每孔加入细胞裂解液（1 mol/L醋酸与等体积无水乙醇的混合液）200 μL，置摇床上低速振荡2～3h，待细胞完全溶解，以空白对照孔调零，在酶标仪上测波长为540 nm处的OD值。

1.2.5 小鼠脾脏自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤活性测定 获得小鼠脾细胞悬液后，以各实验组小鼠脾细胞（1×107mL-1）为效应细胞，以经传代培养的YAC-1细胞（5×105mL-1）为靶细胞，按20∶1的效靶比分别加入脾细胞和YAC-1细胞各50 μL于96孔培养板中，同时设效应细胞对照孔、靶细胞对照孔和空白对照孔。每个样本做3个复孔。置于37℃、5%CO2孵箱中培养4 h，MTT法测细胞存活率。计算NK细胞杀伤活性[11]。

1.3 统计学处理 应用Origen8.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝脏毒理学评价 重复给药实验14 d后，对照组血清中ALT水平为（1.01±0.19）mmol/L，100、250、500 mg/kg剂量组小鼠血清ALT分别为 （1.35±0.27）、（0.87±0.14）、（0.92±0.23）mmol/L。不同药物剂量组与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。重复给药实验14 d后小鼠血清ALT、AST活力见图1。

2.2 不同剂量提取物对小鼠免疫细胞功能的影响 各药物剂量均能显著刺激脾脏淋巴细胞增殖；药物剂量组对NK细胞的杀伤活性无显著影响；500 mg/（kg·d）剂量组能显著增加吞噬细胞的吞噬能力。见图2。

图1 重复给药实验14 d后小鼠血清ALT、AST活力

图2 不同剂量提取物对小鼠免疫细胞功能的影响

3 讨 论

因肝脏是防御毒物来袭的首道防线，大多数针对某种特定分子的毒理学分析均会评价其对肝脏功能和肝组织完整性的不利影响，各种有毒分子均会引起血清中ALT和AST活力的显著增加，因此，对于某些物质而言，肝脏功能和肝组织完整性可作为毒性风险评估的可靠指标[12]。在本实验中，与对照组比较，木蹄层孔菌乙醇提取物处理组小鼠血清中ALT和AST的活力无显著性变化。各药物浓度处理组小鼠ALT、AST水平与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。由此作者推断，本实验采用药物剂量，口服灌胃木蹄层孔菌乙醇提取物对实验动物无明显毒性。然而，关于其持续使用对人类健康是否会造成潜在风险，本研究提供的数据不足以提供全面明确的依据。

免疫系统是动物机体的防御系统，一般由免疫器官、免疫细胞与免疫分子组成，可特异性或非特异性地排除侵入机体的异物。免疫细胞和免疫物质构成特异性免疫和非特异性免疫系统，其功能的增强或抑制均会影响机体免疫功能的发挥，甚至引发免疫性疾病。淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程中的一个重要阶段，淋巴细胞增殖能力的强弱，在某种程度上代表了淋巴细胞功能的高低。本研究结果表明，不同剂量提取物均可加强正常小鼠淋巴细胞的增殖，从而加强免疫细胞的功能。

巨噬细胞是重要的免疫调节和效应细胞，通过吞噬杀伤微生物、抗原提呈和分泌细胞因子等作用进行免疫调控。本研究结果显示，木蹄层孔菌乙醇提取物处理小鼠后，高药物剂量组能增强巨噬细胞的吞噬能力，增强小鼠机体的非特异性免疫功能，低药物剂量组未呈现同样的功能，可能是由于药物剂量太低，未起到相应的促进功能。

NK细胞是一类不表达特异性抗原识别受体的独立淋巴细胞群，无需抗原预先致敏即可直接杀伤靶细胞，包括肿瘤细胞、病毒或某些胞内菌感染的细胞，是机体维持免疫监视功能的主要细胞。本研究结果还显示，不同剂量木蹄层孔菌乙醇提取物对小鼠NK细胞的杀伤活性无显著影响，与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明仍然维持在一个正常水平。

综上所述，木蹄层孔菌乙醇提取物对受试小鼠未造成肝脏的损伤，对其淋巴细胞的增殖、吞噬细胞的吞噬能力起到增强作用，对NK细胞的活性无显著影响。

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Effects of Fomes fomentarius ethanol extract on function of liver and immune cells in mice

Zhao Yanyu，Zhang Zhimin，Wu Mingsong，Wang Zhe，Li Xueying
（Teaching and Researching Section of Medical Genetics，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

Objective To study the effect of Fomes fomentarius ethanol extract on the function of liver and immune cells in mice.Methods Mice were given oral gavage with the low，middle and high doses（100-500 mg/kg）of extract for conducting the 14 d repeated administration test.The activity changes of AST and ALT in liver，spleen lymphocytes proliferation ability，peritoneal macrophage phagocytosis ability and killing activity of spleen natural killer（NK）cells were measured.Results Serum AST and ALT detection results displayed that there was no statistical difference between the treatment group and the control group（P＞0.05）.The various drug concentration groups could significantly stimulate the proliferation of spleen lymphocytes，while had no obvious influence on the killing activity of NK cells.The high drug concentration group[500 mg/（kg·d）]could significantly increase the phagocytosis ability of peritoneal macrophage.Conclusion Oral gavage of Fomes fomentarius ethanol extract has no significant toxicity to the experimental animal liver，no damage to the immune system，moreover，has the ability promoting the proliferation of lymphocytes.

Antineoplastic drugs（TCD）； Liver/injuries； Ethano； Mice； Fomes fomentarius； Immune regulation

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.003

A

1009-5519（2015）21-3214-03

2015-09-09）

遵义医学院博士启动基金（F-702）。

赵彦禹（1975-），男，山东临沂人，博士研究生，主要从事医学遗传学教学和分子遗传学的研究；E-mail：xznuzhao@163.com。

李学英（E-mail：313627366@qq.com）。