电针干预血管性痴呆大鼠海马CA1 区AVP、Aβ1-40 蛋白表达的研究*

冯德琳，刘玉驰，刘 晨，邵 瑛

血管性痴呆( Vascular Dementia，VD) 是一种因脑血管病变，包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中等原因，造成的脑部组织血流运行障碍，引起记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病，是一种严重的认知功能障碍综合征［1］。

针灸对痴呆大鼠脑内AVP 的调整和抑制脑缺血后Aβ 含量高表达的效果已得到肯定［2-4］。本实验以通督调神为治疗原则，选定督脉“百会”、“大椎”穴为电针组穴位，用电针疗法对VD 模型大鼠进行治疗，对比西药组( 吡拉西坦混悬液灌胃) 后，结合Morris 水迷宫对各组大鼠进行行为学测试，运用Western Blot 法对VD 大鼠海马CA1 区中AVP、Aβ1-40 蛋白含量的表达进行检测，探寻电针疗效与AVP 和Aβ1-40 蛋白含量的关系，为针灸治疗血管性痴呆提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本实验选择雄性SPF 级SD 大鼠70 只，体重180 ～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供［合格证号： NO. 44005900000212，许可证号： SCXK( 粤)2013-0020］。分组见图1。

图1 实验动物分组图

假手术组：随机抽取8 只，在相应造模阶段给予一致的手术创伤，但不阻断椎动脉，不夹闭颈总动脉，其余手术过程同VD 模型组。

VD 模型组：采用改良4-VO 法。在阻断大鼠双侧椎动脉的基础上，可逆性夹闭双侧颈总动脉。

阻滞剂组：4-VO 法制备VD 模型成功后，VD 大鼠海马CA1 区注射AVP 受体阻滞剂。

电针1 组：VD 模型组+电针治疗。

电针2 组：阻滞剂组+电针治疗。

西药组：吡拉西坦混悬液灌胃。

1.2 实验动物随机分组方法与过程

将实验大鼠按体重从轻到重，依次编号为1、2、3、……70 号，在随机数目表上第2 横行第1 纵列97开始自左向右。连续抄取8 个数字，起代码为假手术组。其余大鼠均作为血管性痴呆模型造模候选大鼠。进行4-VO 造模7 天后，筛选符合实验标准的VD 模型。除去造模术后死亡12 只，剔除因术后肢体偏瘫严重，不能进行水迷宫测试的4 只；将余下46 只，随机抽取22 只模型大鼠进行AVP 受体阻滞剂注射，其余24只模型大鼠分成3 组，将动物编号后，从随机数字表抄录24 个数字，将各数一律以3 除之，并以余数1、2、3代表A、B、C。注射阻滞剂后，模型大鼠死亡4 只，另2只因注射阻滞剂后出现严重并发症，如腹水，均剔除。最后进入实验的大鼠48 只，分别为：假手术组8 只，模型组8 只，阻滞剂组8 只，电针1 组8 只，电针2 组8只，西药组8 只，造模死亡率为22.9%。

1.3 实验仪器与化学试剂

0.30 mm × 25 mm 华佗牌无菌针灸针，华佗牌SDZ-Ⅱ型电针机、Morris 水迷宫( 广州中医药大学动物实验中心提供) ，双臂数字式脑立体定位仪( 型号68015) 由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供。手术器械：止血钳、有齿镊、持针器、无齿镊、眼科剪、手术刀片、组织剪、眼科镊、止血弯钳、巾钳、4 号缝合线、无创动脉夹等。常规手术材料： 一次性乳胶手套、棉球、纱布等。

托伐普坦片( 批号120405S，规格15 mg，批准文号：国药准字H200110115，浙江大冢制药有限公司生产) ，水合氯醛( 批号20121204，规格250 g，国家集团化学试剂有限公司) ，注射用青霉素钠( 批号X1207619，规格160 万单位/瓶，华北制药股份有限公司) ，吡拉西坦片( 脑复康片，批号130103，规格0.4 mg/片，广东华南药业集团有限公司) ，0.9%氯化钠注射液( 批号T12111903，规格500 ml，四川科伦药业股份有限公司) ，过氧化氢溶液( 批号130403，规格100 ml，东恒健制药有限公司) ，甲紫溶液( 批号120901，规格20 ml，广东恒健制药有限公司) ，安尔碘皮肤消毒剂( 批号20120823，规格60 ml，上海利康消毒高科技有限公司) 。

1.4 动物模型的建立

1.4.1 血管性痴呆动物模型的制备 SD 大鼠术前12 h 禁食，4 h 禁水。按体重以10%水合氯醛腹腔注射(0.35 g/kg) 麻醉。随后将进入麻醉状态的大鼠俯卧位固定于特制的鼠台上，手术刀行颈部背侧正中切口，钝性分离，可见双侧第1 颈椎旁的棘突旁翼小孔，随后以直径0.5 mm 的电凝针头烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，使之造成永久性闭塞。术后伤口处撒少量青霉素粉剂，避免伤口感染，手术线缝合伤口后，放回笼中，保温饲养，注意观察造摸大鼠的生理指征。24 h后，再次将大鼠麻醉，仰卧位固定于特制鼠台上，常规备皮消毒，手术刀行腹侧颈正中切口约1 cm，依次钝性分离出大鼠双侧胸锁乳突肌、胸骨舌肌之间的肌间隙，随后用眼科弯镊小心分离暴露出的颈总动脉和迷走神经，将分离出的颈总动脉穿4 号手术线备用，以手术线穿线后牵拉双侧颈总动脉，用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉15 min 后，再通10 min，反复夹闭3 次。术后以青霉素局部处理防止感染。常规皮肤缝合，碘酊消毒，放回笼中单独饲养，密切观测术后大鼠活动情况。

1.4.2 血管性痴呆大鼠阻滞剂组动物模型的制备术后3 天，待术口愈合及体力恢复后，随机选取22 只VD 大鼠进行海马CA1 区阻滞剂注射。术前12 h 禁食禁水。按实验动物体重，采用10%水合氯醛经腹腔注射麻醉(0.35 g/kg) ，俯卧位固定于脑立体定位仪，剪毛，备皮后安尔碘常规消毒，从大鼠双目锐眦连线中点，手术刀纵向垂直向后切开大鼠头顶部皮肤，长约1.5 cm，深度以切至骨膜为度。分离皮下组织，暴露颅骨，用带有过氧化氢溶液的消毒棉签用力擦拭骨膜后，可见前囟。将前囟交叉点设为原点。参照《大鼠脑立体定位图谱》［5］，选取右侧海马区为注射区。定位坐标： 前 囟 后3. 0 mm，中 线 右 侧2. 0 mm，硬 膜 下2.6 mm。坐标点定位后，用注射器5 号针头，以旋转法小心钻开颅骨，以不穿透硬脑膜为度，有突破感时停止，缓慢拔出针头，将装有阻滞剂的微量进样器垂直脑表面，沿针孔缓慢垂直进针至靶点，至硬脑膜下2.6 mm，准备注射。阻滞剂选择药品混悬液为1 μl AVP 受体阻滞剂( 托伐普坦片Tolvaptan，100 μg/kg)缓慢注入，注射时间5 min(0.2 μlmin) ，留针2 min，以保证溶液充分弥散，再缓慢撤针。术口处撒少量青霉素粉剂消毒，手术线缝合术口。

1.5 动物模型标准依据

术后7 天，对VD 模型大鼠进行Morris 水迷宫试验，筛选模型大鼠，记录每只大鼠的逃避潜伏期后，分别计算假手术组平均值( 记为X) 、标准差( 记为Y) ，以“X+2Y”的标准，剔除不合格大鼠［6］。除假手术组外的其余模型大鼠，如逃避潜伏期大于“X +2Y”则认为符合实验标准的VD 模型。

1.6 处理及治疗方法

假手术组、模型组、阻滞剂组：造模7 天后开始，每日模拟抓取、固定、擦拭酒精等，不予施加任何干预措施。

电针1 组、电针2 组： 造模7 天后开始，穴位以75%酒精棉球常规消毒后，以32 号针灸针分别刺入百会穴( DU20) 、大椎穴( DU14) 。穴位的定位及针刺方法，参照《实验针灸学》［7］为准。百会穴： 位于顶骨正中，向前或向后斜刺2 mm；大椎穴：位于第7 颈椎与第1 胸椎间，背部正中，直刺3 ～5 mm。电针参数选择3 Hz的连续波，持续20 min，中等刺激，以VD 大鼠能耐受、头部轻微抖动为度( 电流强度在1 mA 左右) ，连续治疗5 天，休息2 天为1 个疗程，共治疗2 个疗程。

西药组： 造模7 天后开始，给予吡拉西坦片0.8 mg/kg混悬液灌胃。治疗周期同电针组。

1.7 Morris 水迷宫试验

Morris 水迷宫试验共进行6 天，包括定位航行试验及空间探索实验。为减少应激反应对正式试验的影响，第1 天为适应性训练，大鼠面朝池壁放入水中，游泳60 s，擦干放回笼中结束训练。第2 天开始，进行定位航行试验，以各组实验大鼠的平均成绩作为测试的最后成绩。最后1 天进行空间探索试验，记录模型大鼠首次跨越平台的时间，以及120 s 内大鼠跨越平台次数，计算每只大鼠的平均成绩，检测大鼠的空间学习以及记忆的情况。

1.8 Western Blot 法检测AVP、Aβ1-40 蛋白含量

在水迷宫试验进行完成以后，将实验大鼠以10%水合氯醛(0.35 g/kg) 麻醉后，迅速断头取脑，在冰盘上迅速从两侧大脑半球分离出的海马组织，放入标本瓶，进行Western Blot 法检测。

1.9 数据分析

用SPSS16.0 for windows 统计软件分析，计量资料以均数±标准差(±s) 记录。各组间比较采取独立样本t 检验，以P ＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫结果

电针1 组、西药组与模型组比较，电针2 组与阻滞剂组比较，平均逃避潜伏期减少、首次跨越时间缩短、120 s 内跨越原平台次数增加( P ＜0.05) ；阻滞剂组与模型组比较，逃避潜伏期、首次跨越时间延长，120 s 内跨越原平台次数减少( P ＜0.05) ；电针1 组与西药组比较，平均逃避潜伏期减少、首次跨越时间缩短、120 s 内跨越原平台次数增加( P ＜0.05) 。见表1、2 及图2、3。

图2 各组实验大鼠平均潜伏期对比图

图3 各组大鼠空间探索实验比较图

2.2 Western Blot 法检测结果

电针1 组、西药组对比模型组、电针2 组对比阻滞剂组后，AVP 蛋白含量增多，Aβ1-40 蛋白含量减少( P ＜0.05) ；模型组与假手术组比较，AVP 蛋白含量减少，Aβ1-40 蛋白含量增多( P ＜0.05) ；电针1 组与西药组比较，AVP 蛋白含量较多，Aβ1-40 蛋白含量较少( P ＜0.05) 。见表3、4 及图4 ～6。

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期( ±s)

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期( ±s)

注：与假手术组比较，1) P ＜0.05； 与模型组比较，2) P ＜0.05； 与阻滞剂组比较，3) P ＜0.05。

组别 例数 逃避潜伏期假手术组31.93 ±5.37模型组 8 52.42 ±6.08 1)阻滞剂组 8 54.97 ±7.35 1)2)电针1 组 8 33.81 ±3.17 1)2)电针2 组 8 34.84 ±5.45 1)2)3)西药组 8 35.99 ±3.04 1)2)8

表2 各组大鼠空间探索实验结果( ±s)

表2 各组大鼠空间探索实验结果( ±s)

注：与假手术组比较，1) P ＜0.05； 与模型组比较，2) P ＜0.05； 与阻滞剂组比较，3) P ＜0.05。

组别 例数 首次跨越时间 120 s 内跨越平台次数假手术组8 19.79 ±3.45 17.00 ±2.34模型组 8 72.57 ±7.951) 7.37 ±0.76 1)阻滞剂组 8 69.83 ±8.951)2) 7.21 ±1.97 1)2)电针1 组 8 26.91 ±7.141)2) 15.17 ±1.95 1)2)电针2 组 8 30.59 ±6.291)2)3 ) 15.92 ±1.03 1)2)3)西药组 8 34.86 ±7.751)2) 12.76 ±0.56 1)2)

图4 Western Blot 法检测大鼠海马AVP、Aβ1-40 蛋白含量图

图5 Western Blot 法检测大鼠海马AVP 蛋白含量电泳图

图6 Western Blot 法检测大鼠海马Aβ1-40 蛋白含量电泳图

表3 各组大鼠海马CA1 区AVP 蛋白表达量( ±s)

表3 各组大鼠海马CA1 区AVP 蛋白表达量( ±s)

注：与假手术组比较，1) P ＜0.05； 与模型组比较，2) P ＜0.05； 与阻滞剂组比较，3) P ＜0.05。

组别 例数 AVP 含量假手术组0.450 ±0.012模型组 8 0.315 ±0.1071)阻滞剂组 8 0.220 ±0.2011)2)电针1 组 8 0.467 ±0.2591)2)电针2 组 8 0.499 ±0.1371)2)3)西药组 8 0.415 ±0.0591)2)8

表4 各组大鼠海马CA1 区Aβ1-40 蛋白表达量( ±s)

表4 各组大鼠海马CA1 区Aβ1-40 蛋白表达量( ±s)

注：与假手术组比较，1) P ＜0.05； 与模型组比较，2) P ＜0.05； 与阻滞剂组比较，3) P ＜0.05。

组别 例数 Aβ1-40含量假手术组0.063 ±0.021模型组 8 0.455 ±0.2751)阻滞剂组 8 0.544 ±0.2271)2)电针1 组 8 0.236 ±0.1931)2)电针2 组 8 0.199 ±0.1021)2)3)西药组 8 0.289 ±0.0151)2)8

3 讨论

血管性痴呆属祖国医学“呆病”范畴。其病位在脑，与五脏功能失调密切相关，病理性质多表现为本虚标实，五脏、气血、精髓亏虚为本，以风、火、痰、瘀为标，最终导致脑络瘀阻、脑府与诸脏腑之气不能顺接、脑失所养而渐至痴呆。本研究沿用赖新生教授的治疗方法［8-9］，利用电针“百会”及“大椎”穴，通过通督调神的治疗原则，改善VD 大鼠的学习记忆、日常活动能力。

本研究选择督脉“百会”、“大椎”穴进行电针治疗。督脉为人体“阳脉之海”，是阳脉之总纲，与任、冲二脉同起于胞中。督脉循行于腰背正中，上至头面。手足三阳经经脉循行均上到头面，诸阴经之正，合于相表里阳经经别而上行头面。百会穴位于巅顶中央，居人身之最高点，头为诸阳之会，《针灸聚英》谓手足三阳皆会于此； 头为元神之府，足厥阴肝经与督脉会于巅，交百会，根据穴位的临近作用和远道作用，百会穴具有醒脑开窍、升阳固脱之功。大椎穴为手足三阳经的阳气与督脉的阳气汇聚而成，《循经考穴编》又称“上杼”穴，意指此穴位内的阳气为坚实饱满之状［10］。故针刺此二穴，能够激发脏腑经气，促进阳气的运行，从而达到通督调神、醒脑开窍的功效。有报道显示，针刺督脉穴，可明显降低VD 患者的全血低切比粘度、全血高切比粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数，从而改善微循环，加速大脑病灶及病灶周围组织功能的恢复，进而改善脑部的缺血、缺氧状态，达到治疗脑VD 的目的［11-13］。

AVP( 血管加压素) 又称为加压素或抗利尿激素( ADH) ，是由下丘脑视上核和室旁核细胞合成和分泌的神经内分泌激素，贮存于神经垂体，广泛分布于人体各个脑区、脑脊液和血液中。同许多激素或肽类一样，AVP 同样是通过作用于不同类型受体而发挥出其多种生物学效应。在体内许多组织中，广泛存在着AVP的特异性受体，如心脑血管、泌尿生殖器官、肝脏、血小板、外周血淋巴细胞、单核细胞及肾上腺球状带等，AVP 通过与受体存在的不同靶点结合后，以激活第二信使系统而发挥其各自的生理效应［14］。根据激活第二信使系统不同，可将其划分为V1 和V2 两种类型，又根据V1 受体对不同靶细胞的药理作用的差别将V1受体划分为Vla 和V1b 两种亚型［15］，前者主要分布于血管平滑肌细胞和肝细胞表面，后者主要分布于垂体前叶细胞表面。目前认为AVP 在中枢通过V1 受体发挥作用，它通过AVP-V1 受体调节中枢水、Na+、K+、Cl-等代谢，作用于脑血管平滑肌细胞和毛细血管内皮细胞，调节血脑屏障和脑血液循环［16］。故将中枢神经系统中AVP 受体分为3 种不同类型［17］，V1、V2 受体均有自己的特异性受体拮抗剂。

对AVP 与情绪调控机制的猜测，是基于已发现的隔核及海马中AVP 受体的分布以及神经元投射到边缘系统的的生理因素相关。AVP 亦参与脑的认知功能调节，尤其影响脑的记忆巩固和回忆过程。AVP 已被证实是一种与学习、记忆密切相关的神经肽［18］。Griebel［19］选用V1b 受体的特异性拮抗剂SSR-149415 在一系列小鼠和大鼠模型中都进行了实验，结果证实，AVP 受体确实有很好的抗焦虑症和抑郁症的效果。脑内V1b 受体开始渐渐被认为是防治应激性相关疾病的重要中枢内部靶点［20］。有研究报道脑脊液中AVP 的变化与血液中AVP 含量的变化是相对独立的，因为AVP 不能够通过血脑屏障［21］。缺血缺氧时神经元坏死主要发生在选择性易损脑区，海马CA1区是海马结构中与人类学习记忆关系最为密切的功能区，具有对缺血的选择易损伤性［22］。所以本研究采取受体阻滞剂直接注射到模型大鼠海马CA1 区的方法。因尚无应用AVP 阻滞剂注射模型大鼠CA1 区的先例，故本研究尚属于探索性实验。

本实验所采用改良后的Pulsinelli 四血管阻断(4-VO) 法制作VD 动物模型［23］，可以较好模拟VD的发病机制，及模拟人类脑缺血再灌注损伤的过程。

可以造成血管性痴呆大鼠行为学改变及记忆能力下降。实验结果显示大鼠海马CA1 区注射AVP 受体阻滞剂后，减少了AVP 的蛋白含量；且脑内Aβ1-40 的蛋白含量升高。结合治疗后的行为学改变、AVP 蛋白含量较高的组别( 电针1 组、电针2 组、西药组) 对比AVP 蛋白含量较少的组别( 模型组、阻滞剂组) ，平均逃避潜伏期均减少、首次跨越时间缩短、120 s 内跨越原平台次数增加( P ＜0.05) ；电针1 组与西药组比较，前者在改善VD 大鼠行为学检测的结果中明显优于西药组。在实验室检测中，电针可有效干预VD 大鼠海马CA1 区AVP 以及Aβ1-40 的蛋白含量表达，经电针治疗后，电针1、2 组比较其他各组别，AVP 蛋白含量均有升高，且Aβ1-40 含量减少。其机制可能与改善大鼠海马区AVP、Aβ1-40 在突触传递效率方面的神经调制及神经毒性作用有关，电针可促进脑内AVP的生成，从而减少Aβ1-40 的蛋白含量，从而降低老年斑的生成，减缓血管性痴呆的病变过程。

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