温针灸预处理对不同时间间隔缺血再灌注大鼠心肌的保护作用*

刘卫星，虞跃跃

(1.唐山市中医院，河北 唐山063000;2.河北联合大学，河北 唐山063000)

近年来，冠心病等缺血性心脏病逐年增加［1］。而再灌注治疗是其有效治疗方法之一，而缺血再灌注损伤是其严重的并发症，是影响治疗效果的一个重要因素。目前，针刺抗心肌缺血已经广泛应用于临床与基础研究［2-3］，证实了针灸能通过多种途径改善冠心病心肌缺血临床症状和体征。本实验研究旨在观察温针灸大鼠内关穴预处理后，依据不同时间间隔对大鼠进行造模，观察对大鼠血清NO、NOS 含量的变化及心肌梗死面积的影响，以观察温针灸干预缺血再灌注时对心肌保护的作用、机制及不同时间间隔温针灸刺激内关对心肌缺血的影响是否具有明显的时间依赖性，为温针灸治疗心肌缺血临床和理论研究提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取清洁级健康Wistar 大鼠60 只，雌雄各半，体重(200 ±20)g，由河北联合大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCXKll-00-0010。随机数字表法分为4 组，即:模型组、实验A 组、实验B 组、实验C组，分组每组6 只。常规饲料喂养7 天，室温18℃～22℃，自由摄食、饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌缺血再灌注动物模型制备 参照文献［4］造模方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，四肢接上心电图电极，记录心电图，除毛，气管切开行气管插管，连接小动物呼吸机，控制呼吸频率70 ～85 次/min，潮气量2 ～4.5 ml/100 g。沿胸骨左缘第4 肋间打开胸腔，撕开心包膜暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥间找到左冠状动脉，用0 号缝合线在其下穿过，打一活结，缺血30 min后拉开活结再灌注60 min。缺血的标志为:左心室前壁发绀，心电图ST 段抬高。再灌注的标志为:发绀区充血发红，抬高的ST 段恢复正常。

1.2.2 实验分组 模型组:行心肌缺血再灌注造模;实验A 组:先将大鼠仰卧位固定在实验台上，取大鼠双侧内关穴，内关穴位于大鼠前肢内侧，离腕关节约3 mm的尺桡骨骨缝间，针刺手法采用0. 35 mm ×25 mm针灸针(苏州医疗用品厂有限公司生产华佗牌)，应用单手进针法，直刺入穴位2 ～3 mm 后，于针柄处加艾粒灸(每壮含艾绒约0.2 g，苏州东方艾绒厂)，燃烧时间约为20 min，操作完毕后0.5 h，行心肌缺血再灌注造模;实验B 组:操作方法同上，操作完毕后1.5 h，行心肌缺血再灌注造模;实验C 组:操作方法同上，操作完毕后3 h，行心肌缺血再灌注造模。

1.3 检测指标

1.3.1 心肌梗死面积［5］造模成功后，于左心室注入3%伊文思蓝1 ml 后取下心脏，剪下左室，确定未缺血与缺血心肌。置-20℃冰箱中冷却30 min 后，每隔2 mm，从心尖起将心肌平行切成等厚5 片。置入1%TTC 磷酸缓冲液(PH7.4)，37℃水浴10 min。梗死心肌细胞中因细胞膜损伤脱氢酶释放丢失，因而不被染色，正常心肌含有脱氢酶可被染为红色。梗死面积百分率(%)=左心室组织切片梗死区面积/左心室组织切片总面积×100%。

1.3.2 血清NO、NOS 含量的测定［6］再灌注结束时快速打开腹腔，暴露腹腔静脉，取静脉血5 ml，静置后4℃5000 r/min 离心15 min，取血清，采用分光光度法测定NO、NOS 含量，操作方法按试剂盒(南京建成生物功能研究所，产品批号:20130215，20130222)说明书进行。

2 结果

2.1 对心肌梗死面积的影响

实验A、B、C 组分别与模型组比较，动物心肌梗死均明显减轻、面积缩小，差异性具有统计意义(P ＜0.01 或P ＜0.05)，实验组优于模型组;实验A 组分别与实验组B、C 组比较，心肌梗死均明显减轻、面积缩小，差异性具有统计意义(P ＜0.01 或P ＜0.05)，实验A 组优于实验组B、C 组;实验组B 与实验C 组比较，心肌梗死均明显减轻、面积缩小，差异性具有统计意义(P ＜0.05)，实验B 组优于实验C 组。见表1。

表1 4 组对心肌缺血再灌注心肌梗死面积比较(±s)

表1 4 组对心肌缺血再灌注心肌梗死面积比较(±s)

注:与模型组比较，△P ＜0.01，▲P ＜0.05;与实验A 组比较，* P ＜0.01，○P ＜0.05;与实验B 组比较，☆P ＜0.05。

组别 n 梗死面积(mm2)梗死率(%)占左心室 占心脏模型组6 448.6 ±61.2 7.6 ±1.2 16.5 ±2.4实验A 组 6 169.4 ±32.8△ 2.8 ±0.9△ 5.6 ±1.8△实验B 组 6 245.4 ±56.1△＊ 4.9 ±2.4△○ 9.8 ±4.8△○实验C 组 6 279.9 ±85.6▲＊☆ 6.9 ±2.1* 13.8 ±4.1*

2.2 对血清NO、NOS 含量的影响

心肌缺血再灌注模型组血清中NO 含量明显减少、NOS 活力下降;穴位温针灸预处理不同时间间隔行心肌缺血再灌注造模后，实验A、B 组NO 含量、NOS活力较心肌缺血再灌注模型组明显增强。实验C 组与模型组比较NO、NOS 含量变化不明显。见表2。

表2 4 组对心肌缺血再灌注血清NO、NOS 含量比较

3 讨论

组织缺血再灌注损伤已在多种器官中得到的证明［7］。本研究从中医整体观念出发，注重未病先防，既病防变，实验过程中预先对实验动物进行温针灸处理20 min 后，随后观察其抗损伤作用。

温针灸疗法，是指在毫针的留针过程中，同时在针柄予艾粒加热，既能起到针刺促使气血调和、通经活络的作用，又能起到艾灸调和气血、舒筋通络、解瘀止痛的双重作用。本实验以双侧内关穴为温针灸预处理用穴，温针灸20 min 后起针，起针后再分别间隔0. 5、1.5、3 h 进行心肌缺血再灌注造模，结果显示各组NO、NOS 活性差异显著，间隔0.5 h 可使心肌缺血再灌注后NO 活性显著增强，间隔1.5 h 作用减弱，而间隔3 h 作用不明显。这一结果表明:内关穴穴位温针刺预处理具有明显的抗心肌缺血再灌注损伤作用，且该作用具有明显的时间依赖性，与陈氏等的研究结果一致［8］。

本实验发现，温针灸大鼠内关穴后间隔不同的时间间隔进行心肌造模与模型组比较均能减小心肌梗死面积，但尤以0.5 h 实验A 组(P ＜0.01)、1.5 h 实验B组(P ＜0.01)明显，其作用机制可能与温针灸可以提高NOS 活性、增加NO 生成、增强过氧化反应、减轻细胞过氧化损伤有关，且降低的程度呈时间依赖性［9］。

综上所述，再灌注对心肌细胞有损伤作用，并且通过实验证明这种作用具有明显的时间依赖性，也就是说，在什么时候介入温针灸方法将对抵御随之而来的疾病的发生或减弱疾病对机体的损伤程度至关重要［10］。通过实验证明，温针灸可以减轻缺血再灌注造成的多种损伤，既可以明显改善NO、NOS 的活性，减缓组织坏死程度，这与抗自由基损伤有直接关系。

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［8］ 陈泽斌，王华.大鼠穴位针刺预处理抗脑缺血再灌注损伤作用探讨［J］.针刺研究，2003，28(3):165-169

［9］ 陈泽斌，柯晖，邹锋.针刺预处理抗脑缺血再灌注损伤作用及其分子机制［J］.中医药学刊，2006，24(7):1246-1248

［10］ 孔素萍，张昕，谭奇纹.电针“夹脊”穴对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及凋亡调控基因表达的影响［J］. 中国针灸，2013，33(6):529-532