温通法对脊髓全横断大鼠CGRP 和行为学的影响*

李淑敏，何冠蘅，阮经文△，曾园山，李志玲

(1.广东省工伤康复医院，广东 广州510440;2.中山大学附属第一医院，广东 广州510080;3.中山大学中山医学院，广东 广州510080)

脊髓损伤后的康复是一个漫长的过程，伴随这一过程的治疗投入也是巨大的，但结果差强人意，绝大部分患者最终还是需要在轮椅上度过后半生。正因如此，脊髓损伤后的治疗是医学领域中一个极具挑战性的课题。医务人员和科研工作者也曾经寻求多种诸如手术、药物、功能锻炼等手段来对抗脊髓损伤，但疗效有限。即使在追求突破的今天，人们尝试了被认为最有前途的干细胞移植治疗，从目前有限的临床实验来看，其临床疗效与实验室的结果依然相去甚远，且仍有许多相关问题有待解决。而在这样的背景下，挖掘传统疗法在脊髓损伤治疗中的优势就显得非常必要。作为传统针灸疗法中“针”的部分的针刺疗法，在脊髓损伤的临床治疗中已被广泛应用［1-2］。而另一重要组成部分的“灸”法，在这一领域似乎已被遗忘，极少人对其进行科学、深入的研究。基于此，笔者探索性地对艾条灸治疗脊髓损伤进行了初步的基础性研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SD(Sprague-Dawley)雌性成年大鼠15 只(200 ～250 g)，随机编号为1 ～15，采用EXCEL 编程生成随机数，随机数由大到小分配到3 组中，其所对应的大鼠即被随机分为3 组。①正常对照组(normal group):不损伤，不治疗;②脊髓损伤组(SCI group):脊髓全横断术后不做任何治疗;③艾条灸组(GV-M group):自SCI术后第7 天起，采用艾条灸督脉治疗3 天。各组存活时间均为10 天。

1.2 全横断脊髓损伤大鼠模型的建立

造模方法参考文献［3-4］:成年雌性SD 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(25 mg/kg ～30 mg/kg)进行麻醉，切开皮肤，暴露T10段脊髓。剪开硬脊膜，快速全横断脊髓。充分止血，以明胶海绵覆盖横断处，逐层缝合。术后每日肌注青霉素50000 U/kg，人工排尿，3次/日，至取材或恢复自主排尿功能。

1.3 治疗方法

取穴:取距离SCI 段上下端两个椎体的棘突间隙(T7和T11棘突下方，相当于督脉至阳和脊中两穴)。操作:点燃艾条，对准应灸部位，采用温和灸法于距皮肤3 cm 处进行熏灸，每穴每次10 min，每天1 次，疗程为3 天。

1.4 脊髓取材

各组动物均于实验第10 天行BBB 评分后处死，置于冰盒上，撬开椎板，暴露脊髓，迅速取出T8～12脊髓节段(含损伤区)置于-70℃下保存。取T9～11脊髓节段用于Western blot 检测，T8与T12用于免疫荧光检测。

1.5 检测方法

免疫荧光检测降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)在损伤脊髓邻近节段的表达和分布:冰冻切片，丙酮固定，加1:10 正常山羊血清孵育，加一抗过夜，加入荧光二抗，甘油封片。以PBS 代替一抗作为阴性对照。观察各组脊髓背角CGRP 阳性染色区面积变化。

CGRP 分布示意图如图1 所示，其在脊髓横断面中背角的分布如图2 所示。

图1 CGRP 分布示意图

图2 CGRP 在脊髓背角的分布

Western Blot 检测损伤脊髓组织及邻近节段CGRP 的含量:聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜、封闭，依次加入一抗、二抗，进行显色反应，暗室内曝光。

行为学评分:参照大鼠SCI 后功能评判标准(Basso，Beattie，Bresnahan，简称BBB 评分法)［5］，对各组实验大鼠后肢运动功能进行评分。

1.6 数据分析

2 结果

2.1 各组脊髓背角CGRP 阳性染色区面积观察比较

从图3 中可以直观的看出，SCI 组CGRP 阳性染色区面积，与对照组、艾条灸组比较明显减小，艾条灸组与对照组CGRP 阳性染色区面积相近。

图3 各组脊髓背角CGRP 阳性染色区面积

2.2 CGRP 含量的变化

与艾条灸组、对照组相比，SCI 组的CGRP 条带变得明显窄小，其相对灰度值的比较，差异均具有统计学意义(P ＜0.05);与对照组相比，艾条灸组CGRP 条带的宽度无明显变化，其相对灰度值比较，差异也无统计学意义(P ＞0.05)。见图4。

图4 各组脊髓背角CGRP 条带及灰度值的比较

2.3 行为学改变

术前各组BBB 评分均为21 分。SCI 组和艾条灸组术后评分均为0 分，术后第10 天结果如图5 所示，两组评分较术后均有所增加，且艾条灸组评分增幅较大，但两组评分之间的差异无统计学意义(P ＞0.05)。

图5 脊髓损伤组与艾条灸组BBB 评分比较

3 讨论

针刺治疗疾病，非常强调针下的得气，这在《灵枢·九针十二原》中早有记载:“刺之要，气至而有效”，“刺之而气不至，无问其数”，清楚地表明“气至”是针刺取效的关键。而脊髓损伤的患者，其病灶平面以下的感觉基本消失，随之消失的还有患者对针刺的感应，即在这些部位针刺患者无酸、麻、重、胀的感觉，即没有得气感，从而导致毫针治病“气至则有效”的基本要求难以达到。这可能是目前针刺治疗截瘫病人疗效差的主要原因，其具体缘由值得进一步探讨。与此相反，艾灸治疗疾病，鲜有强调艾灸的操作必须得气的记载和要求，从古至今，多数观点均认为艾灸疗效的关键在于温热效应［6］，而所谓“温热效应”就是通过艾灸燃烧时的热过程影响患者机体的生物效应，比如艾灸对机体热休克蛋白的影响［7-8］，以及艾灸时的红外线辐射，不但为机体细胞代谢、免疫功能提供必要的能量，也为能量缺乏的病态细胞提供活化能［9］。

众所周知，能量过程是生命系统中的基本过程，而热是能量过程的重要表现形式，生命现象的各个层次无不包含热效应［10］。脊髓损伤后的康复需要更多的能量补给，热效应就是提供此种能量的方式之一。艾灸热作为一种特殊的热能介入方式，燃烧时除了能够直接给局部施加热能外，还产生一种十分有效并适宜于机体的远、近红外线。一方面，远红外线能直接作用于人体的表浅部位，利用物理传导方式扩散热量;另一方面，波长短、能量强的近红外线，可穿透组织深达10 mm左右，这些热能通过毛细血管网和经络系统传到更广泛的部位，为人体所吸收［11-12］，从而发挥灸法的热效应，为机体提供能量，也为脊髓损伤后神经再生所需能量提供了保证。

CGRP 作为一种新型的神经肽，在神经系统疾病的发生过程中有着重要的作用。研究发现，脊髓损伤可引起CGRP 表达明显下调，且在1 个月内，CGRP 水平没有恢复［13］。另外，CGRP 能促进SCI 后运动功能的恢复［14］，对神经元的可塑性也起着重要作用［15］。所以，在损伤早期CGRP 的表达情况可以作为评定脊髓修复再生的一个指标。

实验结果表明:通过短暂的3 天艾条灸治疗，艾条灸组大鼠的CGRP 的表达明显高于单纯脊髓损伤组(P ＜0.05)，而接近正常对照组(P ＞0.05)，可能就是通过灸法的能量补给机制，促进了CGRP 的合成。虽然CGRP 主要由神经细胞合成，但也有学者的研究发现，血管内皮自身也能合成［16］。因此，尽管某些平面的神经受损，但血管网络保存完好，在获得灸能的补充后，能迅速合成因脊髓损伤而减少的CGRP，并通过毛细血管网和经络系统对灸能进行区域广泛的传导，跨过损伤区，传导到损伤平面以上的神经，使正常神经细胞迅速合成CGRP，从而能在短时间内上调CGRP 的表达，并接近正常范围。当然，灸法对机体的调节作用是多靶点、多途径的，其对脊髓损伤的治疗除了CGRP之外，应该还存在许多其它的途径和靶点，有待今后继续探索。本实验的另一结果:艾条灸组与单纯脊髓损伤组之间BBB 评分的差异无统计学意义(P ＞0.05)，这可能与治疗时间较短有关。而且，尽管两组的行为学评分无统计学意义，但艾条灸组评分还是表现出优于单纯脊髓损伤组的趋势，值得今后延长治疗时间再进行观察。本次实验总体结果提示，温通法治疗脊髓损伤是有效的，值得推广和深入研究。

从中医角度来看，脊髓损伤的实质是督脉损伤，其所表现的截瘫或四肢瘫痪，以肢体痿废不动为主，常伴有手足不温、背冷、畏风等阳虚之症，这些症状在阴阳属性中属于阴证范畴，为灸法的适应症。加上平面以下针感消失，影响针刺效果。《医学入门·针灸》云:“药之不及，针之不到，必须灸之。”由此可见，无论在现代基础研究还是传统中医理论下，温通法都是值得在脊髓损伤的治疗中推广和应用的。

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