一种火龙果病原真菌的分离鉴定与杀菌剂筛选

魏雅丽，张晓琳，林庆光，范玉龙，黄 惜

(1. 海南大学农学院，海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海南 海口570228;2. 琼海市热作服务中心，海南 嘉积571400)

火龙果(Hylocereus undulatus Britt)，又称红龙果、龙珠果，原产于美洲和中美洲.火龙果植株无主根，侧根大量分布在浅表土层，为多年生攀援性的多肉植物.目前，在中国大陆的海南、广东、广西、福建等省区都有广泛栽培，是热带、亚热带的名优水果之一.火龙果已报道的病害有很多，包括炭疽病(Collectotrichum gloeosporioides)、枯萎病(Fusuraum oxysporium)、黑斑病(Alternaria sp.)、火龙果茎枯病(Mycosphaerella sp.)、火龙果茎斑病(Septogloeum sp.)、茎斑病(Botryosphaeria dothidea)、果腐病(Bipolaris cactivora)、溃疡病(Neoscytalidium dimidiatum )、软腐病(Enterobacter cloacae)、病毒病(Cactus virus X)等20 多种病害［1－7］，有些病害在病症上非常相似，在生产上往往又交叉感染，如果不使用分子检测，仅从病症上很难对某一病害做出准确判断.

海南火龙果的种植面积近年来不断扩大，火龙果病害的发生比较频繁，在湿热多雨季节其发生尤为严重，严重影响了其产量与品质，制约了火龙果产业的发展.李敏等对海南火龙果采摘后其病害发生的种类及病原菌种类等进行了调查，发现目前海南火龙果采摘后其主要病害有炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides 和C.capsici)、根霉病(Rhizopus stolonifer)、焦腐病(Botryodiplodia theobromae)、偶见镰刀菌果腐病(Fusarium sp.)、仙人掌平脐蠕孢(Bipolaris cactivora)和革节孢菌(Scytalidium dimidiatum)［8］.到目前为止，海南还未见火龙果溃疡病的报道.2014 年3 月雨季过后，在海南琼海、万宁等地区的火龙果种植园区内大面积爆发了一种未知病害，表现为枝条缺绿、腐烂，果实变黑，失去食用价值，有些果园几乎颗粒无收，其病原菌目前尚不明确.应当地热作科技人员的邀请，作者前往发病园区进行调研，为了准确鉴定其病原微生物，作者从发生病害的火龙果病害样本上分离了病原微生物，然后通过回接实验和rRNA 基因序列分析鉴定，对病原菌生物学特性进行了研究，第一次在海南发现火龙果感染溃疡病，其病原菌为新暗色柱节孢(Neoscytalidium dimidiatum)，并利用生产上常用的杀菌剂进行抑菌实验，确定了抑制该病原菌的有效农药，为该病害的防治提供了理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料 发病火龙果采集地在海南省琼海市阳江镇，分离病原微生物使用PDA 培养基.PCR －Mix 来自北京百泰克生物技术有限公司，T－载体采用宝生物工程(大连)有限公司生产的pMD19 －T 载体.

1.2 方法

1.2.1 火龙果病菌的分离及筛选 病原菌的分离:切取多块火龙果枝条病害样本，用φ =75%的酒精表面消毒片刻，待挑取病斑部后，吸取200 μL 在PDA 平板上进行涂板，并于30 ℃倒置培养2 ～3 d.此后将分离到的细菌转接到LB 培养基划位被感染的植物组织，加1 mL 无菌水，磨碎，然后将研磨后得到的原液分别稀释100 ×和1000 ×进行线培养，最后将分离到的真菌转接到PDA 平板上培养.

1.2.2 侵染实验 细菌侵染:将细菌单菌落接种到LB 液体培养基中，于30℃培养1 d，然后将细菌4 000 g 离心，用0.01 mol·L－1的MgSO4混合稀释细菌，直到OD600=0.08(约108cfu·L－1)，然后继续以1∶500的比例稀释，用经高压蒸汽灭菌的牙签沾取菌液穿刺活体火龙果活体枝条.

真菌侵染:参考易润华的侵染方法［4］，用经高压蒸汽灭菌的牙签挑取菌丝和孢子，穿刺火龙果活体枝条.侵染后用保鲜袋套住接种部位，内放湿脱脂棉球保湿.继续培养，2 周后观察症状，试验重复数为3 次.1.2.3 PCR 扩增核糖体RNA 序列鉴定 分别提取真菌和细菌基因组DNA，然后通过PCR 分别扩增其18s rRNA(引物ITS 5P:5' －GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG－3'和ITS 4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)或16s rRNA(引物8f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT)，然后将PCR 产物连接pMD19-T 载体，转化大肠杆菌DH5α 感受态，通过菌落PCR 鉴定后，送宝生物工程(大连)有限公司测序.

1.2.4 抑菌筛选实验 选取市场上销售的5 种杀菌剂(表1)，将杀菌剂分别按照100 倍，1 000 倍和10 000倍进行浓度稀释，然后用灭过菌的圆形滤纸(φ5 mm)蘸取药液，放置在均匀涂满菌液的平板中央，以水作为对照(CK)，每个处理5 次重复，放于30℃的培养箱中倒置培养2d，然后测量抑制圈直径，取平均值，计算抑制率.抑制率= (处理抑制圈直径－对照)/(平板直径－对照)×100%.

表1 用于火龙果溃疡病抑菌实验的杀菌剂

2 结果分析

2.1 海南火龙果病害症状 2014 年4 月雨季过后，海南琼海、万宁等地区的火龙果种植园区大面积爆发病害，如图1 所示，发病初期表现为枝条出现圆形凹陷缺绿病斑，然后病斑逐渐转变为桔黄色，随后整个枝条布满密密麻麻的病斑，甚至呈灰板色突起，形成溃烂，果实变黑，有些果园几乎颗粒无收.发病后期溃疡程度加大，甚至出现整枝溃烂，只剩下中间干枯的木质部.果实在发病初期，其鳞片及果实表面出现锈斑，黄色病斑逐渐加深，最后形成溃疡，呈灰白色，果肉变黑，果实表现为干枯和腐烂，失去食用价值.其病状与多种火龙果溃疡病、软腐病、茎斑病等病害症状都非常相似，仅从外观和镜检，很难对病原菌做出准确判断，因此需要进行病原菌的分离鉴定和分子检测.

图1 火龙果在田间的发病症状

2.2 病原菌的分离鉴定 首先从火龙果发病枝条分离病原体，然后根据微生物在培养基上的菌落特征，通过培养的方法分离得到3 个细菌单菌落和1 个真菌单菌落.分别提取细菌和真菌基因组DNA，然后通过PCR 扩增其18s rRNA 或16s rRNA，通过测序和BLAST 分析，得到的分析结果显示，尽管所分离到的细菌在菌落的形态和颜色上少有差别，但BLAST 比对结果显示它们都是泛菌属(Pantoea)细菌，rDNA 序列的相似性在99%以上.所分离到的真菌BLAST 比对最佳结果为Neoscytalidium dimidiatum strain CIH，序列的相似性在99%以上，E 值为零，显示其同源性非常高，所以判断该真菌为新暗色柱节孢(Neoscytalidium dimidiatum)，可能是火龙果溃疡病的病原微生物.

将分离到的病原菌菌株在PDA 培养基上在25℃培养2 d，气生菌丝可长满培养皿;菌落初期白色，3 ～4 d 后逐渐变黑(图2 －A);菌丝有分枝和隔膜、脱节后形成节孢子(图2 －B);孢子为单胞、无色透明，圆柱形、圆形或卵圆形，可以分为3 种类型:节孢子、厚垣孢子和分生孢子.分生孢子单胞，无色透明，椭圆形或长椭圆形.节孢子无色到浅褐色，形态多样，杆状，柱状或腰鼓状，有些相连为节孢子链. 节孢子细胞壁加厚，形成厚垣孢子，深褐色，球形，大小为(5 ～6)μm×(8 ～10)μm(图2 －C—D).

2.3 侵染实验 为了鉴别哪一种微生物是引起火龙果病害的病原微生物，笔者进行了分离微生物的回接实验.分别将3 株细菌和1 株真菌回接到火龙果枝条上，并设置缓冲液为空白对照.结果显示，接种2 周后，3 种细菌均未能造成病害症状，只有在接种真菌的周围产生明显的溃疡病状.两个月后，接种真菌的部位形成大面积溃疡，与田间发病症状一致(图3).随后，笔者对接种的发病组织进行病原菌再分离，从菌丝和孢子的形态特征以及PCR 的检测结果都证明，新暗色柱节孢(N.dimidiatum)是引起海南火龙果溃疡病害的病原微生物.

图2 火龙果溃疡病病原菌菌落及显微形态

图3 所分离的病原微生物回接两周和两个月后同一接种部位的发病症状

2.4 抑菌剂筛选试验 尽管在广东和台湾等地已多次报道火龙果溃疡病［1，3］，但到目前为止，对火龙果溃疡病病菌的化学防治的研究还少有报道.本文为了筛选防治火龙果溃疡病菌(N. dimidiatum)的化学药物，选择了5 种市场上常见的杀菌剂来进行抑菌试验(表1).平板抑菌试验结果表明，在5 种杀菌剂中多菌灵(上海升联化工有限公司)抑制火龙果溃疡病菌最明显，100 倍和100 倍稀释浓度的抑菌率都达到100%，10 000 倍稀释浓度的抑菌率达到55.6%;其次是甲基托布津(江苏龙灯化学有限公司)，三种稀释浓度的抑菌率分别是36.6%，20.6%和18.5%;精甲霜·锰锌(瑞士先正达作物保护有限公司)和达科宁(百菌清，苏州先正达作物保护有限公司)只有在100 倍稀释浓度时才有约20%的抑菌率，1 000 倍以上稀释度都没有抑菌圈;氰烯菌脂(南京农药研究所有限公司)则完全没有表现抑菌功能(表2).

表2 不同杀菌剂对火龙果新暗色柱节孢(Neoscytalidium dimidiatum)的抑菌结果

3 讨 论

火龙果溃疡病是最新发现的一种火龙果病害，世界上第一例火龙果溃疡病是于2012 年在台湾报道［1］，同年在广东，火龙果溃疡病的病原菌也被鉴定为Neoscytalidium dimidiatum［3］.2013 年，马来西亚也首次报道了火龙果溃疡病的发生［4］.最近，广东湛江和广东清远等地也陆续发现火龙果溃疡病，并开始出现该病害继续蔓延的势头［4，8］.2014 年3 月份，海南琼海、万宁等地区的火龙果种植园区大面积爆发了火龙果病害，据当地热作局的科技人员介绍，该病害明显不同于以前出现的病害，传统的防治方法对其未见有效，推测很可能是一种新的病害.由于火龙果已发现的病害有20 多种，加上火龙果组织结构简单，发病部位都集中在茎秆和果实，多种病害的症状都表现为茎秆出现病斑或溃烂，凭借病症和镜检，一般很难对病原菌做出准确判断，因此，对火龙果病害的诊断除了要观察病症和病原菌形态学特性外，还必须依赖分子检测技术.为此，笔者通过实地调研琼海、万宁等地的病害情况，并进行病原菌的分离、回接实验和分子鉴定，最后判断此次大规模病害的病原菌为新暗色柱节孢(N. dimidiatum).从病症图片上看，本文鉴定的火龙果溃疡病与易润华等人在湛江发现的溃疡病似乎有所区别，但从病原菌的菌丝和孢子形态上看，它仍与易润华和张荣等人分离鉴定的Neoscytalidium dimidiatum 非常相似［10］，这说明从病症判断该病的局限性.另外，由于两篇报道都没有病原菌回接发病症状的图片，故不能与本文进行比较，但综合分析，它们很可能都是同一类病原菌.

但到目前为止，对火龙果溃疡病病菌的化学防治的研究还少见报道.李敏等人用19 种农用杀菌剂对火龙果革节孢属病菌(Scytalidium sp.)进行了室内毒力测定，结果表明，腈菌唑的毒力效果最好，其次为丙环唑、苯醚甲环唑、咪鲜胺及咪鲜胺锰盐4 种杀菌剂，异菌脲、氟硅唑+恶唑菌酮、多菌灵，这3 种杀菌剂的抑菌能力也较强［5，9］.郑伟等在室内测定了百菌清、代森锰锌、川东甲托、克菌净、福美双、多菌灵等6种杀菌剂对火龙果茎枯病病菌(Phoma sp. )的抑制作用，结果发现，这6 种杀菌剂在试验浓度下对火龙果茎枯病菌菌丝的生长均有不同程度的抑制作用［11］，但对新暗色柱节孢(N. dimidiatum)的抑制试验还未见报道，本文发现多菌灵和甲基托布津对N.dimidiatum 都有抑制，尤其以多菌灵的抑制率为优，这为病害的防控指明了方向，也为生产上防控火龙果溃疡病提供了理论基础.

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