麻角定喘消痰汤对小儿哮喘发作外周血中Toll样受体表达的影响

佟雪飞,郭海军

(邢台市人民医院 中医科，河北 邢台 054000)



麻角定喘消痰汤对小儿哮喘发作外周血中Toll样受体表达的影响

佟雪飞,郭海军

(邢台市人民医院 中医科，河北 邢台 054000)

目的 探讨麻角定喘消痰汤对哮喘发作患儿外周血中Toll样受体1(Toll-like receptors，TLR1)、TLR2、TLR4表达的影响及可能机制。方法 选择2012年1月～2014年6月期间80例哮喘发作患儿为研究对象。将80例哮喘患儿按照随机数字表法随机分为观察组和对照组各40例。观察组：40例，给予麻角定喘消痰汤治疗；对照组：40例，给予常规治疗。检测受试者治疗前和治疗后TLR1、TLR2、TLR4、IL-6、TNF-α的表达情况。结果 与治疗前比较，治疗后观察组和对照组中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞中TLR1、TLR2的表达增强(P<0.05)，观察组TLR1、TLR2的表达强度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗前和治疗后对照组TLR4的表达无显著差异，与治疗前及同期对照组比较，治疗后观察组TLR4的表达显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗前和治疗后，对照组患儿外周血中IL-6、TNF-α的表达无显著差异，与治疗前及同期对照组比较，治疗后观察组IL-6、TNF-α的表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 麻角定喘消痰汤可提高机体免疫调节能力，抑制患儿气道炎性反应和气道高反应性，最终控制哮喘的发作及进展。

支气管哮喘；急性发作；麻角定喘消痰汤；Toll样受体；机制

支气管哮喘(简称哮喘)是儿呼吸科常见的呼吸系统疾病[1]，多种细胞因子和炎性因子在哮喘发病过程中起介导作用[2]。外周血中中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等细胞在受到外界刺激后，可通过分泌细胞因子，引起Th1/Th2免疫应答失衡，使机体免疫反应方向偏向Th2，进而导致哮喘的发病及哮喘病情的加重[3]。Toll样受体1(Toll-like receptors，TLR1)、TLR2、TLR4是TLRs中的重要成员，可由上述外周血细胞产生[4]。研究[5-7]显示，哮喘患者外周血中TLRs存在异常表达，而TLRs的异常表达参与了哮喘的发病。本研究采用麻角定喘消痰汤治疗哮喘发作患儿，并重点检测了治疗前、治疗后哮喘发作患儿外周血中中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等细胞中TLR1、TLR2、TLR4的表达情况，旨在探讨麻角定喘消痰汤对哮喘发作患儿外周血中TLR1、TLR2、TLR4表达的影响及可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年1月～2014年6月期间被本院收治的80例哮喘发作患儿为研究对象，患儿年龄在3～15岁，上述患儿均符合哮喘的诊断标准[1]。将80例哮喘患儿按照随机数字表法随机分为观察组和对照组各40例。观察组：40例，平均年龄(6.2±4.1)岁，男22例，女18例，平均病程(24.7±3.5)个月。对照组：40例，平均年龄(4.8±2.7)岁，男24例，女16例，平均病程(24.2±3.1)个月。观察组和对照组在年龄、性别、病程方面比较，差异无统计学意义。本研究均获患儿监护人知情并签署知情同意书，同时获本院伦理委员会审核批准。

1.2 纳入排除标准 纳入标准[1]：年龄3～15岁；哮喘急性发作患儿，符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》的诊断标准；支气管舒张剂治疗有效。排除标准[1]：近1个月内呼吸道感染者；免疫系统疾病者；血液系统疾病者；严重肝肾疾病者；严重心脑血管疾病者；结核感染者；排除哮喘外的呼吸系统其他疾病。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组：适量运动，注意休息，避免过度劳累，保持良好情绪，避免接触过敏原，防寒保暖，避免微生物感染，观察28 d。

1.3.2 观察组：麻角定喘消痰汤组方：苏子(10 g)，地龙(10 g)，前胡(10 g)，麻黄(5 g)，丹参(10 g)，浙贝母(10 g)，百部(10 g)，白前(10 g)，大皂角(10 g)，苦杏仁(5 g)，桑白皮(10 g)，枇杷叶(10 g)。袋/剂，1剂/1～2日，温开水冲服，1天3次，4天/疗程。

1.4 TLR1、TLR2、TLR4表达的检测 入院时取受试者静脉血3 mL，肝素抗凝，使用流式细胞仪全血双色免疫荧光直标法检测，每例受试者取抗凝全血300 μL，分装3管，每管均加10 mg/L抗异硫氰酸荧光素单抗。2管实验管分别加抗10 mg/L TLR1-PE、TLR2-PE、TLR4-PE，1管对照管加10 mg/L同型对照IgG2a，避光孵育30 min，抗体购自上海华大基因科技公司，采用CyTOF质谱流式细胞仪(上海华大基因科技公司)获取中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞，数据分析使用FCS Express 5软件。采用同型对照校正非特异染色检测TLR1、TLR2、TLR4的表达情况，以细胞的TLR相对平均荧光强度表示，TLR相对平均荧光强度=TLR平均荧光强度/同型对照平均荧光强度。

1.5 IL-6、TNF-α的检测 于清晨空腹状态下抽取受试者外周静脉血3 mL，3500 r/min离心10 min，上清液-80 ℃保存待测。采用双抗体夹心ELISA法检测血清IL-6、TNF-α等指标，试剂盒购自于上海华大基因，严格按照说明书进行操作。

2 结果

2.1 观察组和对照组外周血中性粒细胞TLR1、TLR2、TLR4的表达 治疗前观察组和对照组中性粒细胞TLR1、TLR2的表达无统计学差异，与治疗前比较，治疗后观察组和对照组中性粒细胞TLR1、TLR2的表达增强(P<0.05)，观察组TLR1、TLR2的表达强度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗前和治疗后对照组TLR4的表达无显著差异，与治疗前及同期对照组比较，治疗后观察组TLR4的表达显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 观察组和对照组外周血中性粒细胞TLR1、TLR2、TLR4的表达情况Tab.1 Expression of peripheral blood neutrophils TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，与治疗前相比，compared with before treatment；#P<0.05，与同期对照组相比，compared with control group

2.2 观察组和对照组外周血肥大细胞TLR1、TLR2、TLR4的表达 治疗前观察组和对照组肥大细胞TLR1、TLR2、TLR4的表达无统计学差异，与治疗前比较，治疗后观察组和对照组肥大细胞TLR1、TLR2的表达增强(P<0.05)，观察组TLR1、TLR2的表达强度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗前和治疗后对照组TLR4的表达无统计学差异，与治疗前及同期对照组比较，治疗后观察组TLR4的表达显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 观察组和对照组外周血肥大细胞中TLR1、TLR2、TLR4的表达情况Tab.2 Expression of peripheral blood mast cells TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，与治疗前相比，compared with before treatment；#P<0.05，与同期对照组相比，compared with control group

2.3 观察组和对照组外周血巨噬细胞TLR1、TLR2、TLR4的表达 治疗前观察组和对照组中性粒细胞TLR1、TLR2、TLR4的表达无统计学差异，与治疗前比较，治疗后观察组和对照组巨噬细胞TLR1、TLR2的表达增强(P<0.05)，观察组TLR1、TLR2的表达强度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗前和治疗后对照组TLR4的表达无统计学差异，与治疗前及同期对照组比较，治疗后观察组TLR4的表达显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 观察组和对照组外周血巨噬细胞中TLR1、TLR2、TLR4的表达情况Tab.3 The expression of peripheral blood macrophages cells TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，与治疗前相比，compared with before treatment；#P<0.05，与同期对照组相比，compared with control group

2.4 观察组和对照组治疗前、治疗后外周血中IL-6、TNF-α的表达 治疗前和治疗后，对照组患儿外周血中IL-6、TNF-α的表达无统计学差异，与治疗前及同期对照组比较，治疗后观察组IL-6、TNF-α的表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 观察组和对照组治疗前、治疗后外周血中IL-6、TNF-α水平比较±s)Tab.4 The levels of peripheral blood IL-6, TNF-α in observation group and control group before and after ±s)

*P<0.05，与治疗前相比，compared with before treatment；#P<0.05，与同期对照组相比，compared with control group

2.5 不良反应 治疗后，2组患儿随访期间均未出现明显的不良反应。

3 讨论

本研究采用麻角定喘消痰汤治疗哮喘急性发作患儿，并重点探讨了麻角定喘消痰汤对哮喘发作患儿外周血中TLR1、TLR2、TLR4表达的影响及可能机制。本研究检测结果显示，哮喘发作患儿在接受麻角定喘消痰汤治疗后，外周血中中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等细胞中TLR1、TLR2、TLR4等TLRs成员的表达均出现显著变化，TLR1、TLR2的水平出现显著上升，TLR4的表达则出现明显下调；而对照组治疗后TLR1、TLR2的表达虽较治疗前上调，但幅度小于麻角定喘消痰汤组，且对照组治疗前和治疗后TLR4的表达并无显著变化。另一方面，随访期间我们发现，哮喘患儿接受麻角定喘消痰汤治疗后未出现明显的不良反应。表明麻角定喘消痰汤对哮喘发作患儿外周血中TLR1、TLR2、TLR4的表达有显著影响，且安全性高。其可促进TLR1、TLR2的分泌，抑制TLR4的表达，进而转变Th1/Th2免疫应答的方向，使机体免疫反应方向偏向Th1，继而提高机体免疫调节功能，抑制哮喘急性发作患儿气道炎性反应，降低机体气道高反应性，有效控制哮喘患儿哮喘的发作及进展。

Kumar等[8]研究发现，哮喘急性发作患者外周血中TLR4的表达显著高于哮喘缓解期患儿及健康儿童，且TLR4可通过调节IL-6、TNF-α等促炎因子的表达参与哮喘的发作。表明外周血中的TLR4的异常表达与哮喘的病情进展密切相关[9-10]，但国内的相关研究较少。本研究在麻角定喘消痰汤治疗前和治疗后分别检测了哮喘发作患儿外周血中IL-6、TNF-α等指标的表达情况，检测结果显示，哮喘急性发作患儿外周血中IL-6、TNF-α等指标的检测含量较治疗前明显下降，而对照组患儿治疗前和治疗后IL-6、TNF-α的表达并无显著变化，这与Satumino等[11]的研究结果接近。Satumino等在研究中采用TLR4阻断剂抑制TLR4的表达，并检测TLR4阻断前和阻断后外周血单核巨噬细胞中IL-6、TNF-α等指标的表达，检测结果显示，在给予TLR4阻断剂后外周血单核巨噬细胞中IL-6、TNF-α等指标表达明显较给予阻断剂之前下调，而给予TLR2阻断剂前后IL-6、TNF-α等指标的表达并无显著改变。表明TLR4可能是通过调控IL-6、TNF-α的表达进而参与哮喘发作的。TLR4可增强IL-6、TNF-α等指标的表达，进而导致哮喘急性发作，而TLR2可能并不直接调控IL-6、TNF-α的表达。TLR4调控IL-6、TNF-α等促炎因子表达的可能机制有：TLR4是脂多糖的受体，机体体内TLR4与脂多糖结合时，可招募TNF受体相关因子及系列接头蛋白，随后在磷酸化的作用下，诱导部分转录因子入胞，进而促进IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的表达，导致哮喘急性发作[12-15]。本研究结果表明，麻角定喘消痰汤治疗哮喘急性发作的另一个可能机制是，通过下调TLR4的表达，抑制IL-6、TNF-α等重要促炎细胞因子的表达，进而减轻哮喘发作患儿气道的炎症水平，抑制患儿气道高反应性，最终控制哮喘的急性发作[16]。

本研究不足之处是入组对象较少、规模较小，另一方面未进一步探讨TLR1、TLR2等指标的可能作用机制，因此后期仍然需要更大规模的研究进一步验证。本研究显示，麻角定喘消痰汤对哮喘发作患儿外周血中TLR1、TLR2、TLR4的表达有显著影响，其可促进TLR1、TLR2的表达，抑制TLR4、IL-6及TNF-α的表达，提高机体免疫调节能力，抑制患儿气道炎性反应和气道高反应性，最终控制哮喘的发作及进展。但相关机制仍然需要进一步深入研究。

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(编校：谭玲)

Influence of Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction on Toll-like receptors expression in peripheral blood of pediatric asthma

TONG Xue-fei,GUO Hai-jun

(Department of Traditional Chinese Medicine, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054000, China)

ObjectiveTo study influence of Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction on TLR1, TLR2, TLR4 expression changes in peripheral blood of pediatric asthma and its possible mechanism.MethodsFrom January 2012 to June 2014, 80 cases of children with asthma were selected as the research object.80 cases of children with asthma according to random number table method were randomly divided into observation group and control group(n=40).Observation group: 40 cases were given Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction; control group: 40 cases were given routine therapy.Expression of TLR1, TLR2 and TLR4, IL-16, TNF-α before and after treatment were tested.ResultsExpression of TLR1, TLR2 enhanced after treatment in neutrophils, mast cells, macrophages, compared with before treatmen(P<0.05).Expression of TLR1, TLR2 were higher than those of control group, and the difference was statistically significant (P< 0.05).Expression of TLR4 in control group before and after treatment had no significant difference.Expression of TLR4 was significantly lower after treatment, compared with before treatment and at the same time in control group, and the difference was statistically significant (P<0.05).Expression of IL-6, TNF-α in control group in peripheral blood in children before and after treatment had no significant difference, but expression of IL-6, TNF-α in observation group were significantly lowered after treatment, compared with before treatment and the same period in control group, and the difference was statistically significant (P<0.01). ConclusionMa Kok Dingchuan Phlegm Decoction could improve immune adjustment ability, inhibit airway inflammatory reaction and improve reactivity of children, and ultimately control the onset and progress of asthma.

bronchial asthma; acute attack; Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction; Toll-like receptors; mechanism

佟雪飞，女，本科，主治医师，研究方向：中医，E-mail：conglitong@163.com。

R259

A

1005-1678(2015)02-0130-04