基于多芳环多吡啶配体的单功能铂配合物DNA结合研究
2015-07-07陈司汉周炳荣
陈司汉,周炳荣
(1.乐山职业技术学院,四川 乐山 614000; 2.南京医科大学 医学科学部,江苏 南京 210029)
基于多芳环多吡啶配体的单功能铂配合物DNA结合研究
陈司汉1,周炳荣2
(1.乐山职业技术学院,四川 乐山 614000; 2.南京医科大学 医学科学部,江苏 南京 210029)
目的 验证配体2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)配合物的DNA结合能力。方法 合成一个多芳环多吡啶配体2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)。配体(L4)与Pt(DMSO)2Cl2反应得到配合物4,表征配合物,通过紫外、荧光和凝胶电泳的方法研究了配合物4的DNA结合能力。结果 紫外和荧光实验表明该配合物均可与DNA嵌入结合,结合常数分别为2.1×104M-1、 2.78×107M-1。凝胶电泳实验表明配合物可使 DNA 超螺旋形式完全解旋,有效扰乱 DNA 的二级结构。结论 配体2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)配合物与 DNA 具有较强的结合能力,可以缓慢结合形成 DNA 的加合物,并且能够有效扰乱DNA构象。
铂配体;DNA结合;合成
癌症一直是困扰人类健康和生命的杀手。铂类抗癌剂对睾丸肿瘤和卵巢癌有特效外,对子宫颈癌、淋巴瘤、膀胱癌等也有治疗作用[1],其中顺铂(cisplatin,DDP) 是一种临床应用极为广泛的含铂类化疗药物,其主要作用靶点是DNA。顺铂对RNA和蛋白质合成的抑制作用较弱,属周期非特异性药物。顺铂虽用于治疗一些癌症,但抗肿瘤谱仍相对狭窄,有些肿瘤细胞系天然抗药性,有些在接受初始治疗后产生抗药性[2-3]。顺铂水溶性不高,需要采取静脉注射给药,这给患者带来了极大的不便[4]。为了克服顺铂的上述缺点,铂类抗肿瘤药物进入了一个快速发展时期,先后出现了5类顺铂类似物(卡铂、奥沙利铂、奈达铂、洛铂、庚铂)[5],但由于结构与顺铂相似,并没有从根本上解决顺铂存在的缺陷[2]。
毒性和抗药性是铂类抗癌药物需要解决的主要问题。在最近的几年中,人类又设计出单功能铂和多核铂,这些铂类配合物与顺铂及其类似物有着完全不同的结构特征[6-8],因而它们与DNA的作用方式也有可能完全不同于顺铂。鉴于迄今为止,有关多核螯合铂类配合物的研究报道的极少,该类配合物的构效关系也还未曾被探讨过[9-10]。本实验中以2,4,6-三(4-亚甲基苯基)-1,3,5-三嗪桥连了3个二(2-吡啶甲基)胺,得到配体2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)。该配体与Pt(DMSO)2Cl2反应得到1个多芳环三核三氮螯合铂配合物(4),研究了配合物4的DNA结合能力。
1 材料与方法
1.1 实验试剂 对甲基苯腈购自 TCI;K2[PtCl4]、2-氯甲基吡啶、2-氨甲基吡啶和二异丙基乙基胺均购自阿拉丁;甲醇、丙酮、氯仿、NBS、偶氮二异丁腈(AIBN)和三氟甲环酸购自南京凯基生物科技发展有限公司。pUC19 质粒 DNA购自大连宝生物有限公司;小牛胸腺DNA(CT-DNA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EB)购自Sigma。
1.2 仪器 Bruker Advance/AV 500 MHz核磁共振仪(瑞士布鲁克公司); LCQ电喷雾质谱仪,Isopro3.0软件(美国ThermoFinnigan公司); Shimadzu RF-5310荧光光谱仪(日本岛津公司);TU-1900紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司); BIO-RAD电泳仪(上海伯乐生命医学产品有限公司);凝胶成像系统Gel Doc XR(美国BioRad公司);DigiDoc-ItTM系统(美国UVP公司)。
1.3 方法
1.3.1 配体及配合物的合成:①合成溴甲基苯腈[11]:向50 mL的茄形瓶中加入对甲基苯2.1 g(18 mmol),NBS 3.846 g(21.6 mmol),AIBN 0.2952 mg(1.8 mmol),氮气保护,将该混合物搅拌2 min,使其混合均匀。升温至60 ℃~70 ℃,至原料反应完全,约5 h,瓶内为红褐色稠状液体。停止搅拌,降至室温,红褐色稠状液体逐渐固化,加入45 mL乙醚洗涤,为灰黑色悬浊液。将该悬浊液抽滤,取滤液(滤液为黄色液体)。将滤液旋蒸至干。
②合成2,4,6-三(4-溴甲基苯基)-1,3,5-三嗪:往25 mL的茄形瓶中加入10 mL三氟甲磺酸,称取5 g(42.7 mmol)对溴甲基苯腈,在冰浴上分批次加入茄形瓶中,剧烈搅拌,加完后,在茄形瓶上插上一根干燥管,搅拌 5 d。反应结束后,往瓶中加入大量水,出现大量白色固体,用浓氨水调节pH至中性。抽滤,固体用水洗涤(3次)。
③ 合成二(2-吡啶甲基)胺[12]: 向250 mL的三口瓶中加入2-氨甲基吡啶(10.3 mL,0.1 mol),Zn粉(20 g),冰醋酸(20 mL),95%乙醇(100 mL)的混合物,60 ℃~70 ℃下剧烈搅拌,氮气保护。往混合物中加入2-吡啶甲醛(9.5 mL,0.1 mol),2 h内加完。补加Zn粉(40 g)、冰醋酸(40 mL),2 h内加完。加完后继续保持60 ℃~70 ℃ 5 h。关闭反应,室温下保持一夜,过滤沉淀,滤液旋蒸。得到浅黄色浆状物,加入过量的 NaOH 过饱和溶液调节至碱性。上层为红油状,乙醚萃取并用无水硫酸镁干燥,旋蒸。
④合成2,4,6-三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)[13]: 向100 mL的茄形瓶中加入二(2-吡啶甲基)胺(1.2038 g,6 mmol),40 mL氯仿,剧烈搅拌。加入有机碱(二异丙基乙基胺)(0.78 g,6 mmol),搅拌一段时间。将称好的 2,4,6-三(4-溴甲基苯基)-1,3,5-三嗪(1.176 g,2 mmol)倒入茄形瓶中,搅拌4 d,至溶液由黄色变为红褐色,停止搅拌(使用薄层色谱监控反应的进度)。用50 mL的水洗涤,并用无水硫酸镁干燥,旋蒸至干。粗产物用硅胶柱色谱(淋洗液为CHCl3:CH3OH=40:1,氨水少许)进行提纯。
⑤合成Pt(DMSO)2Cl2[14]: Pt(DMSO)2Cl2按照文献方法合成:称取K2[PtCl4] 1.245 g(0.003 mol),溶于10 mL二次蒸馏水中,加入DMSO(0.009 mol),室温下静置1 d,析出黄色针状晶体。过滤,用水、乙醇、乙醚。
⑥合成配合物(4):配体L4(63.6 mg,0.0675 mmol)溶于12 mL甲醇,搅拌。Pt(DMSO)2Cl2(85.5 mg,0.203 mmol)用60 mL的甲醇超声溶解,加入上述溶液中,搅拌5 d,溶液由清变浑。抽滤得到黄色固体33 mg,滤液浓缩至2 mL,加入乙醚,有固体出现,继续抽滤得到固体3 mg。
1.3.2 与DNA结合能力:CT-DNA 的储备液配制在5 mmol/L Tris-HCl/50 mmol/L NaCl的水溶液中(pH=7.4),EB也在该缓冲溶液中配制,浓度为2×10-3mol/L,DNA浓度通过测定其 260 nm 处的吸光度来确定(DNA 在 260 nm 处的摩尔消光系数为 6600 M-1cm-1),且在260 nm和280 nm处的吸收强度之比为1.8~1.9,表明该DNA样品不含蛋白质。
① 紫外可见光谱
配合物浓度为2×10-5mol/L,测定前将溶液放在(25±0.1) ℃的恒温水浴中。取石英杯2只,分别加入TE缓冲液2990 μL。在对照杯中加入10 μL TE buffer,在样品杯加入10 μL样品。实验组中加入测试液,其中CT-DNA与配合物(2×10-5mol/L)的摩尔浓度比例为 0.5(DNA/[配合物]),盖上盖子,上下几次摇匀。放入751型分光光度计的比色槽中,使用氢灯,分别测出OD240~OD400的之间的吸收光谱值。记录溶液随时间变化的紫外曲线;按计算公式算出你所制备的DNA的纯度和浓度。
② 荧光光谱
于1批 5 mL刻度试管中加入 110 mL Tris - HCl缓冲溶液,加入 0.4 mL DNA 溶液, 1.0 mL BR溶液,不同量的 MTX溶液,以蒸馏水定容并且摇匀, 避光放置1 h,荧光光谱的测定中激发波长为 525 nm,发射波长为 600 nm。EB-CT-DNA体系的Tris-HCl/NaCl缓冲液(pH=7.4)3 mL,浓度为5×10-5mol/L,向该体系中每次滴加 3 mmol/L 的配合物溶液(用 DMSO 配制)3 μL,在室温下测定每次滴加样品后的荧光光谱,扫描荧光光谱或测定 525 nm 处的荧光强度
③ 琼脂糖凝胶电泳
器具清洗:将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净;根据基因组片段大小,配置琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶加入少量纯水煮沸,西班牙琼脂糖倒入锥形瓶中,摇匀并用锡纸封口,将煮好的凝胶放入65 ℃的水浴锅中,待凝胶冷却至65 ℃时,及时将凝胶倒入干净模具中。待凝胶完全凝固后电泳检测;先将干净的电泳槽排放整齐并做好标记,然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央,胶孔的方向朝向负极;用2 μL×6溴酚黄加入到每一个胶孔中,检测凝胶胶孔是否漏孔。若不漏孔,则可在凝胶孔底部看到一条黄色条带;若漏孔,则看不到条带;.将样品pUC19质粒DNA、6×溴酚黄按3︰1的比例混匀,轻甩后按照规定的顺序上样,上样顺序应与电泳槽上的标记一致,最后点上一定量的Ladder;确认已经正确上样后,双手盖上电泳槽盖,接通电泳仪和电泳槽,最后按键开始电泳;电泳结束之后,带上PE手套,小心滑出凝胶,把凝胶转移到干净的PE手套上,小心 地 将 凝 胶 放 入相 应 标 记的EB染胶盘中,盖 上 盖 子 染30 min。凝胶成像:带上PE手套,将凝胶从染胶盘中捞出,放在染胶时的PE手套上,将凝胶放入凝胶成像系统中,按照凝胶成像系统Gel Doc XR(BioRad公司)拍照。
2 结果
2.1 合成产物结果
合成的溴甲基苯腈为黄色固体。正己烷重结晶,得到1.54 g白色固体(产率为43.8%)。1H NMR(CDCl3):δ=4.41 ppm(s,2H),δ=7.58 ppm(d,2H),δ=7.44 ppm(d,2H);
合成2,4,6-三(4-溴甲基苯基)-1,3,5-三嗪,得到4.7586 g白色粗产物。甲苯重结晶得到3.6518 g白色产品(产率为73.4%),1H NMR(CDCl3):δ=4.58 ppm(s,6H ),δ=7.58 ppm(d,6H),δ=8.70 ppm(d,6H);
合成二(2-吡啶甲基)胺,得到黄色油状物9.5411 g(产率为47.95%)。1H NMR(CDCl3):δ=3.96 ppm(s,4H),δ=7.13 ppm(m,2H),δ=7.33 ppm(d,2H),δ=7.62 ppm(m,2H),δ=8.54 ppm(m,2H);
合成2,4,6-三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)。得到0.318 g纯品(产率为16.88%)。1H NMR(CDCl3):δ=3.82 ppm(s,6H),δ=3.88 ppm(s,12H),δ=7.17 ppm(m,6H),δ=7.62 ppm(q,12H),δ=7.69 ppm(m,6H),δ=8.54 ppm(t,6H),δ=8.70 ppm(d,6H);ESI—MS(+):943.75,[C60H55N12]+;
合成Pt(DMSO)2Cl2,真空干燥得到产品0.9453 g,产率为74.67%;
合成配合物(4),2个固体核磁相同(产率约为58%)。1H NMR(d6-DMSO):δ=4.51 ppm(s,6H),δ=5.05 ppm(d,6H),δ=5.47 ppm(d,6H),δ=7.50 ppm(t,6H),δ=7.71 ppm(d,6H),δ=8.04 ppm(d,6H),δ=8.21 ppm(m,6H),δ=8.41 ppm(d,6H),δ=8.67 ppm(d,6H);ESI-MS(+):545.08,[C60H54N12Pt3Cl3]3+,834.75,[C60H54N12Pt3Cl4]2+。
2.2 与DNA结合能力结果 通过紫外、荧光、和凝胶电泳的方法研究了配合物 4 的 DNA 结合能力。计算得到DNA浓度为5.9015×10-4mol/L。
2.2.1 紫外可见光谱:依赖时间的配合物 4 与 CT-DNA 的紫外吸收光谱研究显示配合物在285 nm处的最大吸收峰强度在反应15 h后产生了50%的减色效应,见图1。此结果表明配合物4是一个较强的DNA结合试剂,作用方式可能为嵌入结合,然而也不排除静电和氢键作用。
图1 r=0.5时配合物4在室温下随时间变化的紫外光谱Fig.1 UV spectrum of complexes 4(r=0.5) change with time at room temperature
滴定表明随着DNA浓度的增加,配合物在285 nm处的吸光度不断降低,见图2,在滴定结束后,盛放配合物的比色皿中出现白色的丝状物质。
图2 配合物4浓度为2×10-5 mol/L,加入不同浓度比r时的紫外光谱Fig.2 UV spectrum of complexes 4 at concentration of 2×10-5 mol/L, adding r at different concentrations
2.2.2 荧光光谱:以配合物 4 与 CT-DNA 作用的荧光滴定光谱中,每次加入配合物的浓度为3 μM,体系中600 nm的发射强度随着配合物4的滴加显著地降低了(荧光强度进行了归一化),见图3。
图3 配合物4与EB-CT-DNA体系荧光作用曲线Fig.3 Curve of action between complexes 4 and EB-CT-DNA fluorescence system
EB-CT-DNA(50 mmol/L EB, 50 mmol/L DNA)体系荧光随加入的配合物4浓度增加而降低的变化曲线。计算结果Kapp为2.78×107M-1。
2.2.3 凝胶电泳研究:配合物4与pUC19质粒DNA在37 ℃温育24 h的凝胶电泳图见图4。此时DNA为大量超螺旋DNA[Form Ⅰ和少量开环DNA(Form Ⅱ)]的混合物。实验中ri(c)为0.66,说明配合物可以有效扰乱DNA构象,见图4。
图4 配合物4与pUC19质粒DNA在37 ℃温育24 h的凝胶电泳图1:DNA空白;2-9:ri 值分别为0.33,0.4125,0.495,0.5775,0.66,0.7425,0.825,0.9075Fig.4 The gel electrophoresis of complexes 4 and pUC19 plasmid DNA incubated at 37 ℃ 24 h 1: DNA blank;2-9:ri=0.33,0.4125,0.495,0.5775,0.66,0.7425,0.825,0.9075
3 讨论
本文合成了一个多芳环多吡啶配体三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4),通过紫外、荧光、和凝胶电泳的方法研究了配合物4的DNA结合能力,结果表明配合物与 DNA 具有较强的结合能力,可以缓慢结合形成 DNA 的加合物,并且能够有效扰乱DNA构象。对于配合物细胞毒活性的研究仍在测试中,配合物4为一个多核的单功能铂配合物,机理明显不同于顺铂,它可为今后不同于顺铂的抗癌药物的研究起一定的指导作用。
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(编校:王冬梅)
Research on single function of platinum complexes of polyaromatic polypyridine ligands on DNA interactions
CHEN Si-han1,ZHOU Bing-rong2
(1.Leshan Vocational and Technical College, Leshan 614000, China; 2.Department of Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)
ObjectiveTo verify the ability of ligand 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl) - aminomethyl phenyl]-1,3,5- triazine (L4) combined with DNA.MethodsSynthesis of an aromatic polypyridyl ligand 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl)-aminomethyl phenyl]-1,3,5-triazine (L4).Complex 4 was obtained by the reaction of ligand(L4) and Pt(DMSO)2Cl2,the complex 4 was characterized, electrospray mass spectroscopy.Methodsby UV, fluorescence, and gel electrophoresis study of the binding ability of complex 4 and DNA.ResultsUV-vis experiments showed that the complexes could be combined with the embedded DNA, the binding constant was 2.1×104M-1, EB-DNA binding experiments also showed that the complexes could be combined with embedded DNA, the calculated Kapp was 2.78×107M-1.Gel electrophoresis experiments showed that the complexes could make DNA from the supercoiled form to complete unwinding, and two level structure effectively disrupt DNA. ConclusionThe ligand of 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl) - aminomethyl phenyl]-1,3,5- triazine (L4) complexes combine with stronger binding ability with DNA, can combine to form DNA complexes, and can effectively disrupt the conformation of DNA.
platinum ligand; DNA binding; synthesis
国家自然科学基金(81000700)
陈司汉,女,硕士,中级讲师,研究方向:生物化学,E-mail:30661641@qq.com。
R979.1
A
1005-1678(2015)02-0035-04