携氧技术在肝移植供肝保存中的应用

贾俊君 李建辉，2 张静 周燕飞 周琳 郑树森，2

肝移植是终末期肝病最有效的治疗方法，虽然心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death，DCD)、劈离式供肝等应用扩大了供肝来源，但相对于不断增加的肝移植等候名单，供肝来源仍然严重不足［1］。供肝保存技术是保证并进一步扩展供肝来源的关键，发展供肝保存技术的关键是避免移植物损伤，尤其是缺血再灌注损伤(ischemic perfusion injury，IRI)。我们前期对减少供肝IRI 做了较系统的研究及综述［2-3］。随着2013 年“杭州宣言”的发布和2015 年起我国人体器官来源只能采用公民逝世后器官捐献，我国供肝短缺形势更加严峻，以DCD 供肝和脂肪肝为代表的扩大标准器官捐献(expand criteria donor，ECD)供器官得到越来越广泛的应用，并且逐渐成为主要供肝来源，但这些供肝对缺血、缺氧更加不耐受［4-5］。

目前，静态冷保存(static cold storage，SCS)是肝移植供肝保存的金标准，机械灌注是供肝保存的新途径，越来越受到肝移植学者的重视［6］。针对肝脏离体保存过程中是否需要额外加氧一直存在争议，组织在深低温的时候需氧量非常少，在0 ～4 ℃时细胞代谢活力大约降至正常的5% ～10%。部分学者认为溶解在保存液中的氧气已经能够满足器官氧耗的需求［7］。而另一部分学者则认为即使在0 ～4 ℃环境中，离体肝脏仍需要0.27 mol·min-1·g-1的氧气，而SCS 并不能满足这个氧耗需求［8］。另外，研究表明低温机械灌注(hypothermic machine perfusion，HMP)过程中肝细胞缺少氧气容易导致缺氧空泡产生，而在灌流液中加入氧气该现象就会消除［9］。

大量研究表明，合适的氧浓度供给有利于增加抗氧化物、维持三磷酸腺苷(ATP)水平和线粒体功能，尤其对于DCD 和ECD 供肝［8，10-11］。携氧技术对ECD 供肝显得尤为重要，本文就携氧技术在供肝保存中的应用及相关机制做一综述。

1 携氧载体

医用级携氧载体一般有两类:(1)血红蛋白类，包括人类自身及其他物种改良的血红蛋白;(2)人造血液，主要是指全氟化碳类物质(perfluorocarbon，PFC)，包括全氟正辛烷、全氟三丁胺、全氟十氢萘、全氟十四氢菲以及全氟溴辛烷等。

1.1 血红蛋白类

血红蛋白类携氧载体最为常用，但较为稀缺，一直都处于供不应求状态。目前，许多公司致力于缓解这一矛盾，将现有血红蛋白进行加工或者其他物种血红蛋白进行基因改造，以实现血制品的长时间保存和增加血红蛋白来源，但是这些产品大多在临床试验阶段，真正用于临床的还很少。这类产品简要进展如下(详见表1):(1)HBOC-201，是基于牛血红蛋白改造而来，目前已经应用于临床非心脏手术患者，并取得理想效果［12］;(2)Hemopure，为牛血红蛋白多聚体，是第1 个批准用于临床的血液代用品［13］，在大鼠DCD 供肝体外保存中效果显著，优于SCS［14］;最近基于Hemopure 配制的携氧灌流液应用于大动物肝移植过程中供肝的机械灌注，结果显示这项氧合技术供肝保存效果明显优于SCS［15］;(3)M101，由海洋无脊椎动物的血红蛋白改造而来，有文献报道在UW 液中加入M101 可以减少大动物肾移植术后移植肾纤维化和无功能的发生［16］，随后又有文献报道M101 结合UW 液在大动物供肝保存方面优于单独使用UW 液［17］;(4)此外，血红蛋白类携氧载体还包括因为不良反应显著而被终止临床试验的DCLHb-HemAssist 等。

表1 血红蛋白类携氧载体介绍

1.2 PFC

血液及血液制品存在HIV、肝炎病毒交叉感染的潜在风险［21］。由于输血安全性问题、需血量增多以及献血量减少等原因，迫使人们努力去寻找一种具有与血液功能相同的代用品。PFC 是研究最多的血液代用品，其黏度低于血液而稍高于水，溶氧能力是血液的20 ～25 倍，并且不同于血红蛋白的溶氧曲线，PFC 遵循亨氏线性法则(Henry＇s linear law)，温度对PFC 携氧能力影响并不大，这一点使其尤其适合用于肝脏低温保存。PFC 最初作为血液代用品用于治疗急性出血和贫血，目前其用途已由单独血液代用品逐渐扩展为需氧治疗的辅助剂，在临床各科室均有潜在的应用价值。PFC 的发展已历经半个世纪，但其临床应用尚非常有限。

目前开发的氟碳乳剂已有3 代:(1)第1 代氟碳乳剂为Fluosol-DA20，美国食品和药品管理局许可用于临床冠状动脉血管成形术中，以增加机体氧气供应，临床观察能减少术中心脏损伤［22］;(2)第2 代氟碳乳剂为Oxygent 和Oxyfluor［23-24］，携氧能力和稳定性均较第1 代有所提高，半衰期24 ～48 h，室温下可存放1 年多，不影响血液动力学;目前Oxygent在美国、欧洲、加拿大已完成了Ⅲ期临床试验，但结果发现使用Oxygent 的冠状动脉旁路移植术患者脑血管事件发生率升高，试验因此而停止;近期俄罗斯获准氟碳类产品Perftoran 为医用［25］，其主要成分为氟萘烷和氟甲基一环己基哌啶;(3)第3 代产品正处在临床前期开发阶段［26］。详见表2。

PFC 产品也有一些缺点和不良反应［22］:(1)PFC是一种氧溶解剂，必须使用高浓度氧气(70% ～100%)才能提供足够的氧气溶解量;(2)循环时间短，使用高浓度(70% ～100%)PFC 可致血黏度升高;(3)流感样症状，输入时可出现急性和短暂的面色潮红、背痛，随之发热和寒战;(4)激活补体系统和吞噬细胞(第1 代明显，第2 代产品中尚未发现)，大剂量PFC 可导致肝淤血和短暂的免疫防御功能受损。

表2 全氟化碳类物质携氧载体介绍

2 携氧方式

2.1 静脉系统吹氧

最简单的供氧方式是直接通过静脉系统向供肝吹入氧气(venous systemic oxygen persufflation，VSOP)。这种方法一般将肝脏浸没于冷保存液中，通过肝上下腔静脉置管接入氧气，肝下下腔静脉端暂时结扎。利用氧气进入静脉产生压力，窦后型小静脉扩张，用27 G 小注射器刺破这些小静脉释放氧气［35］。有两项大鼠实验研究证明VSOP 相比于其他供氧方式可以改善肝功能，降低肝酶水平，减少组织坏死、线粒体产生的凋亡，并且可以减少内质网应激［36-37］，临床试验也证实VSOP 可以保护供肝结构及功能［38-39］。

2.2 氧合器灌流液氧合

最常见的氧合方式是通过氧合器在灌流液中进行氧合。根据氧合器不同又可以分为鼓泡式氧合器和膜式氧合器。一般认为膜式氧合较鼓泡式氧合更适用于临床，因为鼓泡式氧合容易产生气泡导致气栓形成。此外，如果用红细胞作为携氧物质，鼓泡式氧合容易造成红细胞破坏继而引发溶血。

2.3 PFC 单层法和双层法

PFC 为亲脂性物质，不溶于血液、水及其他介质，密度高，表面张力低，因此有其特殊的携氧方式，学术上分为双层法和单层法:(1)双层法最常用，应用这种方法的器官保存液由两层组成，上层为常用器官保存液(如UW 液)，下层为PFC，器官置于双层液体之间，通过不断给下层PFC 补充氧气，使氧气能够弥散进入器官;已有多个移植中心采用双层法保存胰腺［40-41］，肝移植领域也有零星报道［42］;(2)单层法，顾名思义就是将整个器官置于PFC 中保存，动物实验表明单层法更有利于器官的保存，尤其是胰腺、胰岛保存［43-44］;单层法用于肝脏保存还未见报道。

3 携氧技术相关机制和应用

氧是ATP 产生的必需物质，是细胞活动的驱动因素。在肝脏获取的过程中，血流一旦阻断，氧气和营养等物质就停止供应，ATP 持续消耗导致钠钾泵失功、细胞内外电解质浓度差消失，继而引起细胞水肿、钙离子内流、磷酸酶活化，最终导致炎症产生和细胞死亡［45］。随着缺氧的持续，在缺血、缺氧的环境下，黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，而黄嘌呤氧化酶在再灌注阶段氧气存在时，将堆积的酸性产物转化为黄嘌呤、次黄嘌呤及活性氧自由基，引起脂质过氧化甚至细胞破坏［46］。对于DCD 供肝，在供肝血流阻断与肝脏灌洗之间有额外的热缺血时间，导致更加严重的ATP 消耗和更长时间的缺血、缺氧。

过多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是IRI 的核心环节，主要包括O2-、H2O2及脂质过氧化自由基(ROO-)等。适量的ROS 作为体内第二信使，能够调节转录因子活化、细胞生长、凋亡及粘附等生理过程［47］。严重缺氧条件下，导致大量的ATP被消耗殆尽，大量的次黄嘌呤在缺氧组织中不断积累;与此同时，内源性抗氧化剂如超氧化物歧化酶被大量消耗，积累的次黄嘌呤氧化酶催化产生大量ROS。另外，Kupffer 细胞和中性粒细胞的激活、细胞色素系统功能的失调以及儿茶酚胺氧化产物的增加，也大大增加了ROS 的释放，继而引起细胞核损伤，最终导致细胞凋亡、坏死。ROS 导致的细胞凋亡机制不详，可能与以下4 种途径相关［48］:(1)ROS导致脂质过氧化，继而引起促凋亡基因开始活化，诱导细胞凋亡;(2)大量ROS 攻击细胞内正常蛋白质，引起酶丧失活力;(3)ROS 可直接造成DNA 损伤，导致染色体畸变，DNA 结构发生改变;(4)ROS 影响细胞内核基因转录，细胞表型特征改变，诱导细胞凋亡。

临床实践中SCS 往往不进行额外供氧，而对常温和亚低温机械灌注提供额外氧气可增加抗氧化产物、恢复线粒体功能已经基本达成共识，有研究认为应维持氧分压为19.2 kPa 或55.0 kPa，但何为最优参数，还需要进一步数据支持［49-50］。HMP 过程与SCS 类似，目前对于HMP 过程中的氧合问题仍存在争议，但对于DCD 或ECD 而言，普遍认为添加额外的氧气有利于供肝保存，总计为412 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa，下同)的氧分压可以满足肝脏代谢需求［50］。由于肝脏由门静脉(35%)和肝动脉(65%)同时供氧，因此有学者认为肝动脉268 mmHg和门静脉144 mmHg 的氧分压符合肝脏耗氧的生理需求［49］。甚至有学者提倡用纯氧，因其在减少氧化应激和改善肝功能方面要优于浓度为20%的氧［51-52］。

4 展 望

随着供肝供需矛盾的加剧，DCD 和ECD 供肝所占比重逐年增加，携氧技术的应用也必将越来越广泛。此外，PFC 作为一种有效的携氧载体用于SCS、肝脏灌洗以及机械灌注逐渐得到认可。越来越多的研究表明应用PFC 灌洗供肝或者保存肝脏优于传统的保存液。尽管第1 代PFC 的各种不良反应导致其未能在临床广泛应用，但是随着PFC 第2 代、第3 代产品的出现及机械灌注越来越受到重视，今后PFC 在肝脏保存中一定会发挥越来越重要的作用。进一步克服其局限性、拓宽临床应用领域是PFC 今后努力的方向。目前亟需加强临床和实验研究，予以证实PFC 的安全性和有效性。

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