二倍体泥鳅×四倍体泥鳅F1不同发育阶段染色体核型分析

周贺，马海艳，赵睿，江振华，林忠乔，钱聪，李雅娟*

二倍体泥鳅×四倍体泥鳅F1不同发育阶段染色体核型分析

周贺1，马海艳1，赵睿2，江振华1，林忠乔1，钱聪1，李雅娟1*

（1.大连海洋大学，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023；2.北京市水产技术推广站，北京101105）

以中国长江流域天然四倍体泥鳅为父本，大连农贸市场二倍体泥鳅为母本，通过倍间杂交获得杂交三倍体泥鳅，对早期胚胎、6月龄及12月龄染色体核型进行初步分析。结果表明，早期胚胎整3倍体染色体数目为3n=75，核型为16M+7SM+52T，NF=98，亚三倍体染色体数目为3n=73，核型为15M+6SM+52T，NF=94，超三倍体染色体数目为3n=76，核型为16M+6SM+54T，NF=98；6月龄整三倍体染色体数目为3n=75，核型为15M+6SM+ 54T，NF=96，亚三倍体染色体数目为3n=72，核型为15M+6SM+51T，NF=93，超三倍体染色体数目为3n=77，核型为15M+6SM+56T，NF=98；12月龄整三倍体染色体数目为3n=75，核型为12M+8SM+55T，NF=95；亚三倍体染色体数目为3n=71，核型为16M+6SM+49T，NF=93，超三倍体染色体数目为3n=76，核型为18M+8SM+50T，NF= 102。结果表明，二倍体泥鳅×四倍体泥鳅杂交后代是含有三套染色体组的三倍体，不同发育阶段整三倍体染色体数目相同，均为3n=75，但染色体核型表现多态性。非整倍体（超三倍和亚三倍）中增加和缺少的染色体数目及类型无规律可循。

二倍体泥鳅；四倍体泥鳅；F1；不同发育阶段；染色体核型

三倍体鱼类以其可育性差、生长速度快及抗病力强等特性而成为鱼类遗传育种研究热点。四倍体和二倍体杂交理论上可获得100%三倍体。杂交获得三倍体与人工诱导方法相比，避免了繁琐的人工处理程序及理化诱导手段可能对受精卵造成的伤害，提高三倍体孵化率，不会对生态造成外来物种污染，具有良好应用前景。利用天然四倍体与二倍体杂交制备新型杂交三倍体是解决某些鱼类三倍体产业化的难点。

泥鳅存在自然多倍体现象，在日本市场发现起源不明的四倍体泥鳅，但未发现天然四倍体[1-3]。中国长江流域存在大量天然四倍体泥鳅[4-6]。Li等证实我国天然四倍体泥鳅是含四套染色体组遗传四倍体（4n=100）、雌雄均能产生正常的2n配子[7-9]。本研究室利用天然四倍体泥鳅与二倍体杂交制备一种新型杂交三倍体，利用混合胚胎制备染色体标本，对不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成进行研究，结果表明，正、反杂交三倍体泥鳅均含非整倍体（染色体数目3n＜75或3n＞75）[10]。Zhao等报道超三倍及超四倍泥鳅存在[11]。但关于非整倍体产生原因及不同发育阶段染色体核型有无变化目前尚不清楚。因此，本研究以长江流域天然四倍体泥鳅为父本，大连农贸市场二倍体泥鳅为母本，通过倍间杂交获得杂交三倍体泥鳅为研究对象，采用低渗-空气干燥法制片，制备单个胚胎和鳃细胞染色体标本，对早期胚胎、6月龄及12月龄染色体核型进行分析。旨在了解二倍体×四倍体F1不同发育阶段染色体行为，为杂交三倍体泥鳅染色体组稳定性提供细胞学证据。

1 材料与方法

1.1 亲鱼采集

天然四倍体泥鳅（4n=100）来自湖北省赤壁市（雌2尾，雄2尾），二倍体泥鳅（2n=50）来自大连农贸市场（雌2尾，雄2尾）。实验室水族箱暂养，暂养温度为（22±1）℃。体长为11.4～18.6 cm，体重10.15～63.13 g。

1.2 人工催产及授精

天然四倍体泥鳅与大连农贸市场二倍体泥鳅进行1∶1杂交，人工催产，干法受精，配制2n♀× 4n♂杂交组合。

1.3 幼鱼培育

孵化和幼鱼培育温度为（25±1）℃。经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通。及时用吸管吸出死亡胚胎。

1.4 染色体标本制备

1.4.1 早期胚胎染色体标本制备

分别取发育眼胞期单个胚胎30～50个，用镊子去卵膜和卵黄放入盛有0.0025%秋水仙素中处理45 min，0.8%柠檬酸钠低渗20 min，卡诺固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定，冷冻过夜。冷滴片，Olympus AH2油镜下拍照。

1.4.2 鳃细胞染色体标本制备

采用稍加修改的PHA体内二次注射法[12]和快速制备鱼类染色体方法[13]制备鳃细胞染色体标本，即将每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液，剂量为6 μg·g-1（鱼体质量），18～20 h后第2次注射同样剂量PHA，继续作用4～6 h后活体腹腔注射体积分数为0.1%秋水仙素溶液，剂量为6 μg·g-1（鱼体质量），再次作用2～3 h后，解剖取鳃。将取下来的鳃样本用体积分数为0.8%柠檬酸钠溶液2～3 mL在室温下低渗45 min，再用卡诺固定液固定3次，每次15 min，采用空气干燥法制备染色体标本，然后用体积分数为10%Giemsa染液染色2 h，自来水冲洗干净后自然风干，显微镜下镜检染色体并拍照。

1.5 核型分析

选染色体分散良好，无重叠的完整中期分裂相5个，测量染色体绝对长度及长臂与短臂长度，计算每条染色体平均相对长度和臂比。核型分析参照Levan等标准进行[14]。染色体长臂和短臂比值在1.0～1.7的为中部着丝粒染色体（M），1.7～3.0的为亚中部着丝粒染色体（SM），3.0～7.0的为亚端部着丝粒染色体（ST），7以上的为端部着丝粒染色体（T）。

2 结果与分析

2.1 早期胚胎染色体核型分析

杂交三倍体泥鳅早期胚胎染色体整三倍体的染色体数目为3n=75，其核型公式为16M+7SM+ 52T，臂数NF=98，增加4条亚中部着丝点染色体、缺少4条端部着丝点染色体（见图1A）；亚三倍体染色体数目为3n=73，核型公式为15M+6 SM+ 52T，臂数NF=94，缺少2条端部着丝点染色体（见图1B）；超三倍体的染色体数目为3n=76，核型公式为16M+6SM+54T，臂数NF=98，增加1条中部着丝点染色体（见图1C）。

图1 杂交三倍体泥鳅早期胚胎染色体中期分裂相及核型Fig.1Metaphase cells of early embryo chromosome and karyotypes of original mated

2.26 月龄染色体核型分析

6月龄杂交三倍体泥鳅整三倍体染色体数目为3n=75，其核型公式为15M+6SM+54T，臂数NF=96（见图2A）；亚三倍体染色体数目为3n=72，核型公式为15M+6SM+51T，臂数NF=93，缺少3条端部着丝点染色体（见图2B）；超三倍体染色体数目为3n= 77，核型公式为15M+6SM+56T，臂数NF=98，增加2条端部着丝点染色体（见图2C）。

2.312 月龄染色体核型分析

12月龄杂交三倍体泥鳅整三倍体染色体数目为3n=75，其核型公式为12M+8SM+55T，臂数NF=95，缺少3条中部着丝点染色体，增加2条亚中部着丝点染色体，增加1条端部着丝点染色体（见图3A）；亚三倍体染色体数目为3n=71，核型公式为16M+6SM+49T，臂数NF=93，增加1条中部着丝点染色体，缺少5条端部着丝点染色体（见图3B）；超三倍体染色体数目为3n=76，核型公式为18M+8SM+50T，臂数NF=102，增加3条中部着丝点染色体，增加2条亚中部着丝点染色体，缺少4条端部着丝点染色体（见图3C）。

图26 月龄杂交三倍体泥鳅染色体中期分裂相及核型Fig.2Metaphase cells of six month age chromosome and karyotypes of original mated

图312 月龄杂交三倍体泥鳅染色体中期分裂相及核型Fig.3Metaphase cells of twelve month age chromosome and karyotypes of original mated

4 讨论与结论

非整倍体是染色体数目变异的一种类型，非整倍体生物是指染色体组中增添或减少个别染色体的生物。在动物中，非整倍体常致死或引起发育障碍[15-16]。贝类是低等动物，能够耐受某些非整倍体存在，Wang等研究结果表明，在多种贝类中非整倍体可存活，在太平洋牡蛎中至少已发现12种类型的非整倍体可存活，能正常生长，并表现出优势[17-18]；在合浦珠母贝也发现有5种非整倍体存活[19]；在皱纹盘鲍中也发现非整倍体个体[20]。Li等报道二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅杂交，正、反交（2n×4n，4n×2n）后代均出现大量能存活的非整三倍体个体（3n＞75或3n＜75），说明利用天然四倍体泥鳅和二倍体泥鳅杂交制备杂交三倍体在养殖生产上具有推广价值[10]，这与Zhang等报道超三倍体泥鳅能存活结果[16]一致。本研究对二倍体×四倍体F1不同发育阶段染色体核型分析结果表明，早期胚胎、6月龄及12月龄整三倍体染色体数目均为75，但在染色体核型上存在差异，表现为端部、亚中部、中部染色体缺少或增加。早期胚胎、6月龄及12月龄非整倍体泥鳅染色体数目及核型均表现差异。总之，不仅出现大量非整倍体染色体数目，核型发生随机变化，缺少和增加染色体无规律可循。

非整倍体产生原因是在细胞减数分裂时偶然发生染色体不配对、不分离、分离延迟等，形成比正常配子（n）多一条染色体的配子（n+1）和比正常少一条染色体的配子（n-1）。这些配子与正常配子结合或相互结合时，形成各种非整倍体。二倍体与四倍体杂交产生非整三倍体的原因，Guo等在研究太平洋牡砺四倍体性腺发育和减数分裂后，认为四倍体后代中非整倍体数量增加是因为减数分裂中同源染色体不完全配对形成单价体和三价体所致[21]。姜波等在二倍体与四倍体杂交产生三倍体牡蛎群体中检测到非整倍体，认为非整倍体产生是由于四倍体父本在精子发生过程中减数分裂发生失误，形成三价体或单价体，产生非整倍体的精子所致[22]。Allen等认为三倍体基因组不稳定，其原因可能是三倍体逐渐失去1套染色体组，形成嵌合体，进一步还原为二倍体[23]。Li等对我国天然四倍体泥鳅雌、雄生殖细胞染色体减数分裂行为进行研究，发现我国天然四倍体泥鳅中无论雌、雄均由0～6个四价染色体和38～50个二价染色体组成[8]。四价体的存在为天然四倍体泥鳅产生非整倍体配子提供细胞遗传学证据。因此，这些非整倍体产生的原因可能是四倍体父母本在减数分裂过程中，四价染色体不均衡分离而产生非整倍体配子所致。

本研究结果表明，二倍体泥鳅×四倍体泥鳅杂交后代含三套染色体组的三倍体。不同发育阶段整三倍体染色体数目相同，均为3n=75，但染色体核型表现多态性。非整倍体（超三倍体和亚三倍体）中增加和缺少的染色体数目及类型无规律可循。本试验结果可为杂交三倍体泥鳅染色体组稳定性提供细胞学证据，为我国三倍体鱼类产业化探索高效易行新途径提供理论参考。

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Chromosome karyotype analysis of different developmental stages F1 by diploid loach×tetraploid loach/

ZHOU He1,MA Haiyan1,ZHAO Rui2,JIANG Zhenhua1, LIN Zhongqiao1,QIAN Cong1,LI Yajuan1(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian Liaoning 116023, China;2.Fisheries Technology Extension Station of Beijing,Beijing 101105,China)

Chromosomal karyotype of early embryos,six month age sample and twelve month age sample were analyzed by different ploidy from the cross of hybridtriploid loach in the Yangtze River China natural tetraploid loach as male parent,Dalian farmers market diploid loach as female parent.The results showed that karyotype and fundamental number were determined to be 3n=75,16M+7SM+52T,NF=98 in triploid,3n=73,15M+6SM+52T,NF=94 in sub-triploid,3n=76,16M+6SM+54T,NF=98 in super triploid,3n= 75,15M+6SM+54T,NF=96 in triploid of six month age,3n=72,15M+6SM+51T,NF=93 in sub-triploid of six month,3n=77,15M+6SM+56T,NF=98 in super triploid of six month age,3n=75,12M+8SM+55T,NF=95 intriploid of twelve month age,3n=71,16M+6SM+49T,NF=93 in sub-triploid of twelve month age,3n=76, 18M+8SM+50T,NF=102 in super triploid of twelve month age.The results showed that hybrids(diploid loach×tetraploid loach)were triploid with the same chromosome number 3n=75(three sets of chromosomes) in different developmental stages,but polymorphism on karyotype.The number and the type of chromosome (increase and deletion)are no rules in aneuploid(hypertriploid and hypotriploid).

diploid loach;tetraploid loach;F1;different development stages;chromosome karyotype

S966.4；Q343.2+4

A

1005-9369（2015）07-0070-06

时间2015-7-9 14:42:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.014.html

周贺,马海艳,赵睿,等.二倍体泥鳅×四倍体泥鳅F1不同发育阶段染色体核型分析[J].东北农业大学学报,2015,46(7)∶70-75.

Zhou He,Ma Haiyan,Zhao Rui,et al.Chromosome karyotype analysis of different developmental stages F1by diploid loach×tetraploid loach[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶70-75.(in Chinese with English abstract)

2015-01-22

国家自然科学基金（31272650）

周贺（1985-），女，讲师，博士，研究方向为水产动物遗传育种。E-mail:zhouhe@dlou.edu.cn

*通讯作者：李雅娟，教授，硕士生导师，研究方向为水产动物遗传育种。E-mail:liyajuan@dlou.edu.cn