混合盐碱胁迫下丛枝菌根真菌对紫花苜蓿生长及2种酚酸含量的影响

赵 琦，包玉英

（内蒙古大学 生命科学学院，呼和浩特010021）

内蒙古自治区的盐碱地主要是由地理位置和人为不合理灌溉形成的［1］。随着耕地盐渍化面积的逐年递增，农牧业生产已经受到严重影响。因此，培养耐盐碱的作物新品种是利用和改良盐碱土壤的一种有效措施［2］。紫花苜蓿是一种多年生豆科牧草植物，在盐碱地中具有较强的耐寒、耐盐碱特性和明显的高产优势［3］，且紫花苜蓿若干品种已经在内蒙古盐碱地区进行相关的引种试验［4］。内蒙古地区的盐碱土壤环境中丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）资 源 丰 富［5］，一 方 面 盐 碱 生 境 对AMF的多样性与生理生态功能产生直接影响［6］，另一方面AMF 与植物的根系共生形成菌根，能够显著改善植物养分和水分的吸收，影响植物的生理代谢过程，增强植物的抗逆性［7］。摩西球囊霉是一类对环境适应能力强、应用范围广的丛枝菌根真菌，并对紫花苜蓿作用时间最早、作用效果最佳，比其余种类的AMF 更能显著地促进紫花苜蓿的生长发育［8］。

近几年研究发现，盐碱胁迫对紫花苜蓿的生长［9］、组织结构［10］、根系发育［11］、种子萌发［12］、遗传多 样性［13］、光 合 作 用［14－15］与 抗 氧 化［16］等 特 性 均 产生影响，且在单盐胁迫条件下接种AMF 能够调节紫花苜蓿的生理生长来增加植物的耐盐适应性［17－18］。酚酸类物质是植物生长过程中所产生的一类重要次生代谢产物，其可以通过增加植物细胞壁厚度［19］以及调控抗氧化酶活性来增加植物的抗逆能 力［20－22］，有研 究 表 明 接 种AMF 能 够 促 进 宿 主 植物体内酚酸含量的积累［23］。但是，在混合盐碱胁迫条件下，接种摩西球囊霉对紫花苜蓿生长以及体内酚酸含量的影响却鲜有报道。因此，本试验以摩西球囊霉为接种菌剂，通过盆栽实验，研究在混合盐碱胁迫下，接种AMF 处理对紫花苜蓿生长的影响以及与植物体内酚酸含量的关系。为充分利用AMF资源提高紫花苜蓿品质、改良盐碱地等提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 供试材料

供试植物为“中苜一号”紫花苜蓿（Medicago sativa L．），种子由山东新泰周全农业科技有限公司提供；供试菌种为摩西球囊霉（Glomus mosseae），由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供；培养基质为蛭石和河沙混合而成，在121 ℃、141 kPa下灭菌2h，取出晾凉后，再重复1次，以确保基质中不含任何土著AMF。

1．2 材料培养与处理

（1）混合盐碱胁迫处理：以蒸馏水（CK，pH 为7．03）作对比，将NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3按不同摩尔比混合［24］模拟出4 种盐浓度（25、75、100、150mmol·L－1；盐胁迫）、16种pH 梯度（pH 8．39～10．90；碱胁迫），共17个处理（表1）。（2）接种处理：分为接种AMF（采用层播法，每盆接种5g菌剂）处理与不接菌（每盆施5g灭菌接种物，以保持微生物区系一致性）处理。试验设计共34个处理组合，每个处理组合重复3 次，共102个盆钵，随机排列。

表1 各处理液的盐分组成、盐浓度、摩尔比及pH 值Table 1 Salt composition，salt concentration，molar ratio and pH of solutions in mixed salt treatments

用白色塑料花盆（12cm×13cm×15cm，70%酒精浸泡1h，自来水冲洗干净，晾干）装混有10g蛭石的沙土1．5kg，每盆播种30 粒紫花苜蓿种子（1%NaClO 消毒10min），7d 后间苗至每盆20株。在温室内培养35d后，开始对紫花苜蓿进行盐碱胁迫处理，按表1分别透灌相应处理溶液100mL，2d 1次，共浇5次（共10d）。再稳定培养4d后，进行存活率、株高、总生物量的测量；取紫花苜蓿的叶片进行可溶性蛋白质、脯氨酸含量的测定；取紫花苜蓿的地上部分进行阿魏酸、水杨酸含量的测定。

1．3 测定指标及方法

幼苗存活率用计数法测定；株高用直尺测量；总生物量用称重法测定；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G－250 染色法测定；游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸法测定［25］；阿魏酸、水杨酸含量利用叶日贵等［26］方法测定。其中，阿魏酸、水杨酸含量的测定先根据标准品绘制标准曲线，再据此测定样品的含量。过程如下：先将阿魏酸、水杨酸标准品储液分别用DMSO 按1∶4∶4∶4∶4比例梯度稀释，制得5份标准品使用液；再对标准品使用液检测结果进行分析，以待测物的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，获得线性方程（表2）。

表2 各标准品的线性关系Table 2 Linear relationships of standard sample

1．4 数据处理

采用SPSS V 21．0和Excel 2010软件进行数据分析。

2 结果与分析

2．1 AMF 对混合盐碱胁迫下紫花苜蓿幼苗生长的影响

2．1．1 存活率 幼苗存活率是植物耐盐碱能力的综合指标之一。图1所示，在盐浓度0～150mmol·L－1、pH 值7．03～8．48条件下（A 比例组），接种AMF和未接菌紫花苜蓿幼苗存活率均为100%；在盐浓度为0～25mmol·L－1下，B、C、D 比例组的接菌和未接菌苜蓿幼苗的存活率也均为100%，在盐浓度大于25mmol·L－1开始出现死亡。即在混合盐碱胁迫条件下，紫花苜蓿幼苗的存活率受碱胁迫（pH 值）的影响比盐胁迫更敏感。随着盐碱梯度的不断增加，高盐浓度（≥75mmol·L－1）与高pH 值（≥9．19）的协同作用导致紫花苜蓿的存活率明显降低，在盐浓度大于75mmol·L－1下，B、C、D 比例组接菌处理比未接菌处理幼苗的存活率高，如它们接菌处理的存活率在盐浓度为150mmol·L－1时，分别比未接菌处理显著提高了59．5%、60．6%和28．8%（P＜0．05）。从整体上分析，紫花苜蓿幼苗的存活率在接菌处理下显著高于未接种处理（P＜0．05），且在盐胁迫、碱胁迫、盐碱胁迫以及接种AMF处理下均受到显著影响（P＜0．001），同时受到AMF与碱胁迫、盐胁迫、盐碱胁迫的交互作用显著影响（P＜0．001），说明接种AMF 提高了盐碱混合胁迫下紫花苜蓿幼苗的存活率。

2．1．2 株高 图1显示，非盐碱条件（CK）下，接菌处理组紫花苜蓿幼苗的株高比未接菌处理组显著高20%（P＜0．001）；盐碱条件下，接种AMF处理组与未接菌处理组的株高均随着盐碱梯度的增加而显著下降且表现为A＞B＞C＞D，即盐碱胁迫抑制了紫花苜蓿的株高；除D25接菌处理组比相应未接菌处理组提高了41．8%且差异不显著（P＞0．05）外，其余A、B、C、D 各个处理组的株高在接菌处理下均比相应未接菌处理提高且差异显著（P＜0．05）。整体上分析，紫花苜蓿幼苗株高在接菌处理下显著高于未接菌处理（P＜0．001），并且受到盐碱胁迫、碱胁迫、盐胁迫与接种AMF 处理的显著影响（P ＜0．01），也受到AMF 与碱胁迫、盐碱胁迫的交互作用显著影响（P＜0．01）；但AMF与盐胁迫的交互作用对紫花苜蓿的株高影响不显著（P＞0．05）。说明混合盐碱条件下，接种AMF 对碱胁迫条件下紫花苜蓿株高的影响比盐胁迫条件下更为显著，但总体上接种AMF 缓解了盐碱胁迫的抑制作用，显著增加了盐碱胁迫下紫花苜蓿的株高。

2．1．3 总生物量 从图1可知，非盐碱条件（CK）下，接菌处理的紫花苜蓿幼苗总生物量比未接菌的显著高130%（P＜0．001）；在盐碱胁迫条件下，接种AMF处理组和未接菌处理组的紫花苜蓿总生物量随着盐碱梯度的增加而下降，且表现为A＞B＞C＞D，即盐碱胁迫抑制了紫花苜蓿的生长；除接菌处理组D75的总生物量比相应未接菌组提高了7．1%但差异不显著（P＜0．05）外，其余A、B、C、D 各个处理组的总生物量接菌的比相应未接菌的均显著提高。整体上分析，紫花苜蓿幼苗总生物量表现为接菌处理组显著高于未接菌处理组（P＜0．001），并受到盐胁迫、碱胁迫、盐碱胁迫与接种AMF的显著影响（P＜0．001），也同时受到AMF与盐胁迫、盐碱胁迫的交互作用的显著影响（P＜0．01）；但是，AMF 与碱胁迫的交互作用对紫花苜蓿的总生物量影响差异不显著（P＞0．05）。说明接种AMF 对紫花苜蓿总生物量影响，在盐胁迫条件下比混合盐碱条件下表现得更为明显；但总体上接种AMF 能够维持植物的正常生长，从而增加紫花苜蓿的总生物量。

2．2 AMF对紫花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

2．2．1 脯氨酸含量 植物体内脯氨酸含量一定程度上反映植物的抗逆性，积累的脯氨酸含量多说明抗逆能力强，因此脯氨酸含量可以作为植物抗逆的生理指标。从图2所示，非盐碱条件（CK）下，接菌处理紫花苜蓿幼苗的脯氨酸含量比未接菌处理显著高3%（P＜0．05）；在盐碱胁迫条件下，接种AMF处理组和未接菌处理组的紫花苜蓿中脯氨酸含量随着盐碱梯度的增加而增加，且表现为D＞C＞B＞A，即在盐碱胁迫的协同作用下导致脯氨酸的大量积累，与碱胁迫相比，盐胁迫下的脯氨酸含量的增长率更高（与其它盐浓度相比，盐浓度150 mmol·L－1时，脯氨酸含量最高）；此外，接菌处理组的脯氨酸含量比相应未接菌组显著提高（P＜0．05），在150 mmol·L－1，pH 值10．9条件下，D150接菌处理组的比相应未接菌组的脯氨酸含量显著提高211%（P＜0．001）。整体上分析，紫花苜蓿幼苗的脯氨酸含量表现为接菌处理组显著高于未接菌处理组（P＜0．01），且受到碱胁迫、盐胁迫、盐碱胁迫与接种AMF的显著影响（P＜0．001），也同时受到AMF与碱胁迫、盐胁迫、盐碱胁迫之间的交互作用的显著影响（P＜0．001）。表明接种AMF能显著提高紫花苜蓿中脯氨酸的含量，从而增加寄主植物的渗透调节能力，增强植物的抗盐碱性。

图1 混合盐碱胁迫对紫花苜蓿存活率、株高和总生物量的影响“M＋”和“M－”分别表示植物接种和未接种摩西球囊霉；不同小写字母表示相同接种条件下处理间在0．05水平存在显著性差异；下同Fig．1 Effects of various salt－alkaline mixed stress conditions on the survival rate，height and total biomass of alfalfa“M＋”and“M－”shows that plants were inoculated and not inoculated with G．mossese，respectively；Different lowercase letters within same inoculation indicate significantly different among treatments at 0．05level；The same as below．

图2 混合盐碱胁迫对紫花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响Fig．2 Effects of various salt－alkaline mixed stress conditions on the proline and soluble protein contents of alfalfa

2．2．2 可溶性蛋白质含量 从图2可知，非盐碱条件（CK）下，接菌处理的紫花苜蓿幼苗的可溶性蛋白质含量比未接菌处理显著高9．2%（P ＜0．001）；盐碱条件下，接种AMF处理组和未接菌处理组的紫花苜蓿的可溶性蛋白质含量随着盐碱梯度的增加而降低，且表现为A＞B＞C＞D，即盐碱胁迫促进了紫花苜蓿中可溶性蛋白质的分解；在pH 值≥9．18条件下，未接菌处理组显著降低，而在pH值≥10．23条件下，接菌处理组才出现显著降低，说明接种AMF降低了可溶性蛋白质对碱胁迫的敏感度；在盐浓度为25mmol·L－1条件下，D 比例组接菌比未接菌的幼苗高9．5%但差异不显著（P＞0．05），A、B、C 比例组接菌比相应未接菌的幼苗显著提高（P＜0．001）；在盐浓度为100 mmol·L－1时，C比例组接菌比相应未接菌的幼苗高25．9%（P＜0．001），A、B、D 比例组接菌比未接菌的幼苗高但差异不显著（P＞0．05）。整体上分析，紫花苜蓿幼苗的可溶性蛋白质含量表现为接菌处理组显著高于未接菌处理组（P＜0．001），且受到盐胁迫、碱胁迫、盐碱胁迫以及接种AMF 的显著影响（P＜0．001）；同时受到AMF 与碱胁迫（P＜0．01）、盐碱胁迫（P＜0．001）之间的交互作用的显著影响；但是，AMF与盐胁迫之间的交互作用对紫花苜蓿可溶性蛋白质含量影响差异不显著（P＞0．05）。说明混合盐碱条件下，接种AMF 对紫花苜蓿可溶性蛋白质含量的作用，碱胁迫更为显著，接种AMF增加了可溶性蛋白质在盐碱胁迫下的稳定性。

2．3 AMF 对紫花苜蓿酚酸含量的影响

2．3．1 水杨酸含量 从图3 所示，非盐碱条件（CK）下，未接种AMF的紫花苜蓿幼苗的水杨酸含量比接菌处理的显著高623．9%（P＜0．05）；盐碱条件下，接菌处理组和未接菌处理组的水杨酸含量随着盐碱梯度的增加而增加，且表现为D＞C＞B＞A，即植物通过水杨酸的积累来调节自身的抗盐碱性；未接菌处理组C25比相应接菌处理组的水杨酸含量显著高107．3%（P＜0．05），其余各个处理组未接菌比相应接菌的水杨酸含量高（P＜0．01）。整体上分析，紫花苜蓿幼苗的水杨酸含量表现为未接菌处理组显著高于接菌处理组（P＜0．01），且受到盐胁迫、碱胁迫、盐碱胁迫与接种AMF 的显著影响（P＜0．001）；也同时受到AMF 与盐胁迫、碱胁迫、盐碱胁迫之间的交互作用的显著影响（P＜0．001）；说明紫花苜蓿通过提高水杨酸含量来调节植物的抗盐碱性的反应接种AMF 比未接菌的弱。而且，无论是否在盐碱条件下，水杨酸可能既参与了对紫花苜蓿抗盐碱性的调节作用，又参与了紫花苜蓿的防御系统抑制AMF 侵染，导致接菌处理组比未接菌处理组紫花苜蓿中水杨酸的含量低。

图3 混合盐碱胁迫对紫花苜蓿水杨酸和阿魏酸含量的影响Fig．3 Effects of various salt－alkaline mixed stress conditions on the salicylic acid and ferulic acid contents of alfalfa

2．3．2 阿魏酸含量 从图3 所示，非盐碱条件（CK）下，接种AMF处理的紫花苜蓿幼苗的阿魏酸含量比未接菌处理的显著低59．1%（P＜0．01），即接种AMF 抑制了阿魏酸的积累，这可能是由于阿魏酸参与了紫花苜蓿的防御系统抑制AMF 侵染；盐碱条件下，未接菌处理组和接菌处理组的阿魏酸含量随着盐碱梯度的增加而增加，且表现为D＞C＞B＞A，即阿魏酸的积累增加了紫花苜蓿的抗盐碱性；除了B150接菌处理组比未接菌处理组的显著高40．5%（P＜0．05）外，其余A、B、C、D 各个处理组的阿魏酸含量接菌的比相应未接菌的高但差异不显著。整体上分析，盐碱条件下，紫花苜蓿幼苗阿魏酸含量表现为接菌处理组比相应未接菌处理组的阿魏酸含量高且差异不显著（P＞0．05），且受到盐胁迫（P＜0．001）、碱胁迫（P＜0．001）与接种AMF（P＜0．01）的显著影响；但是，盐碱胁迫以及AMF 与盐胁迫、碱胁迫、盐碱胁迫之间的交互作用对紫花苜蓿的阿魏酸含量的影响均为差异不显著（P＞0．05）；说明阿魏酸可能需要调节来自于盐碱胁迫以及AMF侵染两个方面的影响，导致接种AMF在盐碱条件下对紫花苜蓿中阿魏酸的含量无影响。

3 讨论与结论

存活率、株高与总生物量可以直接的表现出盐碱胁迫对植物的生长抑制效应。陆爽等［17］与张璐等［18］认为AMF增加了紫花苜蓿根系的吸收面积，促进了宿主植物对养分与水分的吸收，从而提高植株的耐盐碱性，有利于植物的生长。本研究结果显示，AMF能提高紫花苜蓿的存活率、株高与总生物量，这与前人的研究结果完全一致。

AMF能够促进宿主植物体内脯氨酸、可溶性蛋白质的积累，从而维持细胞内的渗透势，保证植物细胞的正常生理代谢，缓解了紫花苜蓿在盐胁迫下的生长抑制效应［27］。脯氨酸是提高植物耐盐性的重要渗透调节物质，而且积累脯氨酸是在低水势情况下保持渗透平衡的一种有效的保护机制［28］。很多研究表明在盐条件下接种AMF使宿主植物积累更高的脯氨酸和可溶性蛋白质的含量［29－31］。本实验表明，混合盐碱胁迫下，盐胁迫引起的水势与Na＋的变化以及碱浓度引起的高pH 均会诱导植物内渗透调节物质的积累［9］，且接种AMF会产生更多的渗透调节物质降低渗透势，来提高宿主植物的耐盐碱适应性。

水杨酸是一种重要的信号分子，能够诱导植物产生抗逆性。Medina等［32］认为水杨酸作为一种防御化合物抵御AMF 侵染宿主植物，所以接菌的植物中水杨酸的含量要低，这与本结果相符合。但是，在盐碱条件下，Zhang等［33］认为，AMF 可能是通 过过氧化氢，水杨酸和一氧化氮的级联信号通路提高根内的酚酸合成来增加宿主植物的抗逆性，这与本结果不相符。因此，本文认为一方面由于水杨酸的大量积累提高植物的抗氧化酶活性，降低膜脂的过氧化水平，增强植物的抗逆能力，另一方面水杨酸作为防御化合物抵御AMF 的侵染，从而使得接菌植物中的水杨酸含量维持在较低的水平。也有人认为AMF的种类不同，宿主植物不同，采样时间和所测定的植物器官不同均会影响到水杨酸含量的测定结果［34］。所以，接种AMF 增加或减少寄主植物中水杨酸水平的原因仍然需要研究。

Medina等［35］研究显示外源阿魏酸对AMF 的侵染具有一定的抑制作用。这表明植物体内的阿魏酸可能抑制AMF的侵染导致宿主植物体内的阿魏酸含量降低，从而导致本研究中非盐碱条件下，接菌处理组的紫花苜蓿中阿魏酸含量低。而李冬美［36］的研究显示外源阿魏酸能够提高植物体内的抗氧化酶活性。因此，盐碱梯度的增加导致植物体内的阿魏酸积累，从而降低了茎叶组织细胞膜脂的过氧化，进而提高植物的抗盐碱能力。而阿魏酸是与植物细胞壁相结合［37］以及相比较于其它酚酸表现出对pH的稳定性［38］，可能导致了本研究中盐碱胁迫下AMF对紫花苜蓿中阿魏酸的含量无影响。

综上，混合盐碱胁迫下，接种AMF 能够促进紫花苜蓿的生理生长，并且酚酸与植物抗逆之间也有密切的联系。这有利于探索丛枝菌根真菌对经济作物的生长发育的促进作用，通过研究逆境下AMF对植物体内酚酸含量的影响，从而为其它次级代谢产物对植物耐盐碱适应性的调控提供科学依据。而且，为盐渍化土壤治理与植被恢复提供了重要的经济价值与科学意义。

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