油菜素内酯对霍山石斛抗冷性能的调控效应

吴进东

（皖西学院，安徽六安237012）

温度是植物生长的必要条件，然而低温却是限制植物生长的重要因素。低温胁迫会导致植物生物膜透性增大、活性氧（ROS）积累引起氧化胁迫。植物可以通过调节抗氧化酶活性和积累渗透调节物质来增强抗逆性［1－2］。

霍山 石 斛（Dendrobium huoshanense Tang et Cheng），为兰科石斛属多年生草本植物，产于大别山区安徽霍山及邻近地区，为中药石斛中的上品。其含有人体所需的多种有益成分，具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力等作用［3］。霍山石斛对生态环境要求严格，生长适温为18～32 ℃，最适生长期温度为25 ℃左右，在5 ℃以下或35 ℃以上会停止生长［4］。研究表明，金钗石斛在25℃条件下植株长势最佳［5］，铁皮石斛在20 ℃具有更高的多糖含量［6］。霍山及邻近地区冬季易遭遇低温，探寻缓解霍山石斛低温胁迫的有效途径是其科学栽培生产中的当务之急。通过喷施植物生长调节剂提高植物抗冷性措施在生产上已得到了广泛应用。张艳嫣等［7］发现外源硒可以提高铁皮石斛幼苗的抗寒性；胡春霞［8］指出多效唑、6－苄基嘌呤可以提高南果梨苗木抗寒性；罗立津等［9］报道脱落酸对甜椒幼苗抗寒性有诱导效应。油菜素内酯（brassinosteroids，BR）具有极强生理活性，在促进作物生长，提高产量，改善品质，增强抗逆性等方面具有显著效应［10－12］。

目前，有关霍山石斛的研究主要集中在种苗繁殖 与栽培技 术［13－14］以 及 药 效 成 分 分 析［15－16］等 方 面，有关利用外源物质调控霍山石斛抗逆性的研究报道不多，BR 对低温胁迫下霍山石斛抗冷性影响的研究未见报道，因此本试验开展了这方面的研究，以期为霍山石斛的科学栽培管理提供理论参考。

1 材料和方法

1．1 试验设计

从2年生霍山石斛植株群体中，选择具有长势一致当年生茎干的植株，在新萌发茎干5个月龄（9月）时，置于昼／夜分别为（25±1）℃／（15±1）℃、相对湿度为85%、光照度为3 600lx的人工智能培养箱（赛福PRX－450D 型）中预处理1周，分别在入箱第1天和第7天对其喷施不同浓度梯度的油菜素内酯（BR），再对其进行低温胁迫48h，处理昼／夜温度为（4±1）℃／（2±1）℃，后移至昼／夜分别为（25±1）℃／（15±1）℃继续生长。

BR 选用0．2%可溶性粉剂（上海源叶生物科技有限公司生产），配制时先用少量70%乙醇溶解原药，然后再用清水配成所需浓度。试验共设5个BR浓度：0（对照）、0．01、0．05、0．10、0．50mg·L－1，对照（0mg·L－1）处理喷施等量清水，每个浓度处理20株。分别于低温处理后第0、5、10、15 天时进行叶片取样，第15天时进行茎取样，取样后立即用液氮快速冷冻30min，然后再转移到－40 ℃的低温冰箱中保存、备测。每个处理3次重复。

1．2 测定指标及方法

霍山石斛叶片叶绿素含量采用丙酮比色法测定［17］。叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定［17］；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚显色法测定［17］；过氧化氢酶（CAT）活 性 采 用 紫 外 吸 收 法 测 定［17］；丙 二 醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定［17］；相对电导率采用电解质外渗法测定［17］；脯氨酸（Pro）含量采用磺基水杨酸法测定［17］；茎中可溶性糖含量采用蒽酮法测定［17］。

1．3 数据统计分析

数据应用DPS 7．05软件进行方差分析，Duncan检验进行处理间多重比较，用Excel 2003作图。

2 结果与分析

2．1 BR 预处理对低温胁迫霍山石斛叶片叶绿素含量的影响

低温胁迫后，各BR 处理霍山石斛的叶片叶绿素含量随时间推移而不断显著降低（P＜0．05）；不同浓度BR 处理间叶绿素含量差异显著，且均显著高于对照（P＜0．05），并随BR 处理浓度增加呈现先升高后降低的趋势，处理时间越长这种趋势越明显（图1）。其中，0．05和0．10mg·L－1BR 处理叶绿素含量较高，并显著高于其余处理，其次为0．01和0．50mg·L－1处理，对照（0mg·L－1）的叶绿素含量始终最低，与所有BR处理均有显著差异。在低温胁迫第15天时，0．01、0．05、0．10、0．50mg·L－1BR 处理叶片叶绿素含量比对照分别提高了43．75%、55．21%、64．58%、38．54%。以上结果表明BR 处理显著减轻了低温胁迫造成的霍山石斛幼苗叶片叶绿素降解损失。

2．2 BR 预处理对低温胁迫霍山石斛叶片抗氧化酶系统的影响

植物的抗氧化酶系统可以及时清除体内过多的ROS，使膜脂过氧化程度减弱。低温胁迫后，霍山石斛的叶片SOD、POD 和CAT 活性随处理时间的变化趋势均呈单峰曲线，并均在第10天时达到最高，其中SOD、CAT 活性在低温胁迫后第5 天的提高幅度显著大于POD 活性的提高幅度（P＜0．05）。同期叶片SOD、POD 和CAT 活性在不同浓度BR处理间均差异显著，且均显著高于CK（P＜0．05），随BR 处理浓度增加呈现出先升高后降低的趋势，处理时间越长这种趋势越明显（图2，A～C）。其中，各抗氧化酶活性均在0．10和0．05mg·L－1处理时较高，0．01和0．50mg·L－1处理次之，对照（0 mg·L－1）最低；低温胁迫第15 天时，0．01、0．05、0．10和0．50 mg·L－1BR 处理叶片SOD 活性比CK 分别显著提高了59．30%、80．81%、89．53%、52．33%，POD活性比CK分别显著提高了22．22%、50．00%、59．26%、24．07%，而CAT 活性分别比对照显著提高了41．14%、55．12%、65．20%、38．37%。可见，低温胁迫条件下，各浓度BR 处理均显著提高了霍山石斛幼苗叶片抗氧化酶系统的活性，并以0．10 mg·L－1BR 处理的效果最佳，有效缓解了低温对幼苗生长的抑制。

图1 不同浓度油菜素内酯预处理霍山石斛叶片叶绿素含量在低温胁迫下的变化同期不同小写字母表示处理间在0．05水平存在显著性差异；＊表示同一BR 处理内处理后与处理前（0d）有显著性差异；下同Fig．1 Changes of chlorophyll content in D．huoshanense seedlings leaves sprayed with different concentrations of BR under chilling stress The different normal letters within the same time indicated significant differences among treatments at 0．05level；＊indicated significant differences between after and before treatment（0d）within the same BR treatment at 0．05level；The same as below

2．3 BR预处理对低温胁迫霍山石斛叶片MDA 含量与相对电导率的影响

低温胁迫后，霍山石斛的叶片MDA 含量与相对电导率均随时间推移而不断显著升高（P ＜0．05）；MDA 含量和相对电导率在不同浓度BR 处理间均差异显著，且均显著低于CK（P＜0．05）；在同一胁迫时间内，叶片MDA 含量和相对电导率均随着BR 浓度的升高而呈现先降低后升高的趋势，并 在0．1mg·L－1BR处理时达到最低值（图3）。其中，低温胁迫15d时，霍山石斛叶片MDA 含量在0．01、0．05、0．10、0．50mg·L－1BR处理下分别比对照（0mg·L）显著降低了26．58%、47．35%、52．13%、20．86%（图3，A），同期相对电导率则比对照分别降低了19．21%、35．98%、40．24%、20．12%（图3，B）。以上结果说明BR 处理有效减轻了低温胁迫下霍山石斛叶片膜脂过氧化水平，保护了细胞结构完整性。

图2 不同浓度油菜素内酯预处理对低温胁迫霍山石斛叶片SOD、POD 和CAT 活性的影响Fig．2 Activities of SOD，POD and CAT in D．huoshanense seedlings leaves spraying with different concentrations of BR under chilling stress

图3 不同浓度油菜素内酯预处理对低温胁迫霍山石斛叶片MDA 含量和相对电导率的影响Fig．3 MDA content and relative conductivity in D．huoshanense seedlings leaves spraying with different concentrations of BR under chilling stress

图4 不同浓度油菜素内酯预处理对低温胁迫霍山石斛叶片脯氨酸和茎中可溶性糖含量的影响Fig．4 Proline content in leaves and soluble sugar content in stem of D．huoshanense seedlings spraying with different concentrations of BR under chilling stress

2．4 BR 预处理对低温胁迫霍山石斛叶片脯氨酸含量与茎中可溶性糖含量的影响

在低温胁迫15d时，BR 显著提高了霍山石斛叶片中脯氨酸含量与茎中可溶性糖含量（P ＜0．05）；各处理叶片中脯氨酸含量和茎中可溶性糖含量均随着BR 处理浓度的逐渐升高呈现出先升高后降低的趋势，且均显著高于对照，并均在浓度为0．1 mg·L－1时达到最大值（图4，A、B）。其中，叶片中脯氨酸含量在0．01、0．05、0．10、0．50mg·L－1BR处理下比对照分别显著提高了33．63%、55．75%、64．16%、45．13%，而同期茎中可溶性糖含量比对照分 别 显 著 提 高 了23．04%、31．41%、32．98%、25．13%；叶片脯氨酸含量在各处理浓度间均存在显著性差异，而茎中可溶性糖含量在0．01与0．50mg·L－1、0．10与0．05mg·L－1BR 处理间差异不显著（P＞0．05）。可见，各浓度BR 处理均显著提高了低温胁迫下霍山石斛茎叶中渗透调节物质含量，有效增强了幼苗抵御低温的能力。

3 讨 论

3．1 低温胁迫下霍山石斛叶片叶绿素含量的变化

叶绿素含量是植物对低温胁迫反应敏感性的生理指标。本试验结果表明，低温胁迫下霍山石斛叶片叶绿素含量持续下降，与张艳嫣等［7］在铁皮石斛研究的结论一致。可能由于低温胁迫下，植物叶片叶绿体的结构和功能受到破坏，叶绿体的合成受到抑制所致。

3．2 低温胁迫下霍山石斛抗氧化酶系统、MDA 含量及相对电导率的变化

抗氧化酶系统是细胞抵御活性氧伤害的酶保护系统，在清除超氧自由基，控制膜脂过氧化作用，保护细胞膜正常代谢方面起重要作用。试验表明，低温胁迫下，霍山石斛植株体内SOD、POD、CAT 活性变化趋势均呈单峰曲线，表明低温胁迫对抗氧化酶活性提高有一定的诱导作用，这种诱导能力在一定时间里有效，超过一定时间，诱导能力就会减弱或丧失。试验结论与罗萍等［18］对在低温胁迫下橡胶的研究结果一致。抗氧化酶的峰值在低温胁迫后第10 天，但各种酶的变化不一致，其中SOD、CAT 活性在低温胁迫后第5 天的提高幅度显著大于POD活性的提高幅度，POD 活性在低温胁迫后第10 天有大幅度提高，与于飞等［19］的研究结论一致。植株受到逆境胁迫时，植物体内的各抗氧化系统的作用对象之间存在动态平衡，不同的抗氧化系统在体内相互影响，协同调节体内的抗氧化作用，清除过量的活性氧及自由基，控制细胞质膜的过氧化作用，保护膜结构，减少逆境胁迫对膜结构的伤害。但也有一些研究与本实验结果不一致。姜岩岩等［20］得出耐低温性番茄通过提高POD 和CAT 的活性来提高抗低温能力；而低温敏感性番茄通过提高SOD 的活性来适应低温。这可能与不同植物抗冷性不同有关。MDA 含量反映生物膜脂过氧化的程度，相对电导率是膜透性大小的指标，它们水平的高低反映了植物生物膜受伤害的程度。本试验结果表明，低温胁迫致使霍山石斛植株MDA 含量与相对电导率值均升高，与武辉等［1］、张艳嫣等［7］结果一致。低温胁迫使植株ROS水平提高，植物膜脂过氧化水平升高，MDA 大量积累，造成膜透性上升，电解质外渗，使相对电导率值变大，导致细胞膜系统的严重损伤。

3．3 BR 对霍山石斛低温胁迫的缓解效应

与袁凌云等［11］、王佳等［21］、惠竹梅等［22］分别在番茄、油菜、葡萄上的研究结论一致，本试验结果表明，BR 提高了植物抗寒性作用的机理在于提高植物叶片抗氧化酶系统的活性，从而降低叶片MDA含量与相对电导率，减轻细胞膜脂过氧化水平，减少叶绿素的降解；提高叶片中脯氨酸含量与茎中可溶性糖含量。脯氨酸和可溶性糖都是良好的渗透调节物质，可以提高细胞液的浓度，增加细胞持水组织中的非结冰水，从而降低细胞质的冰点，还可缓冲细胞质过度脱水，保护细胞质胶体不致遇冷凝固，有助于植物在逆境胁迫下保持膜结构的完整性［23］。但外源物质对逆境胁迫下植物的抗氧化酶系统的影响复杂，也有一些研究结果与本试验不一致。如陆晓民等［24］认为BR 能显著地提高黄瓜幼苗抗氧化酶SOD、POD 活性，而对CAT 活性无明显的影响；黄玉辉等［25］指出BR 处理苦瓜幼苗的MDA 含量随处理时间呈现先升高后降低的趋势，在胁迫第4 天达到最高，而本试验中MDA 含量随低温处理时间持续升高，这可能是黄玉辉等［25］设置低温胁迫的温度较高（8℃）所致。上述不一致可能是因为不同植物抗冷性能不同所致，其准确的机理有待进一步研究。喷施BR 提高了霍山石斛茎中可溶性糖含量，可能由于BR 能够提高植物光合作用，加强蔗糖的运输，改善植物对碳源的利用，提高细胞内可溶性糖的合成酶活性，与刘德兵等［26］对香蕉幼苗的研究结论一致。另外，BR 是具有超浓度抑制特点的植物生长调节剂［27］，试验得出其适宜的使用浓度为0．10 mg·L－1左右。

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