极危孑遗蕨类中华水韭有性生殖的形态学研究

刘子玥，邢建娇，路 靖，刘保东

（哈尔滨师范大学 黑龙江省普通高等学校植物生物学重点实验室，哈尔滨150025）

水韭科（Isoetaceae）是水韭亚门孑遗的原始维管植物，具有孤立的演化路线，在经典分类系统和现代分子系统中都占有特殊的地位，是研究维管植物起源演化、古生态变迁的活化石［1］。全世界约有250种水韭，零散分布在热带亚热带等北半球地区，不同种类对原产地生境都高度依赖，起源或分布中心尚未查明。中国的水韭资源尚无系统的调查，目前已知的只有5种，而且都是特产种［2］。由于受经济活动的干扰，近几十年来迅速衰退，面临灭绝，都被列为国家一级保护物种［3］。

水韭科都是小型草本植物，野生数量极少，与禾本科（Gramineae）水生植物相似，研究工作历来都受到取材的困扰［4］，主要成果多集中在生态习性［5］、种类鉴定［6］、形态结构［7］、细胞遗传［8］、分子系统［9］、生理濒危［10］等方面，孢粉形态［11］和叶舌结构［7］一直是研究的重点。比较而言生殖研究还很匮乏，主要成果有Isoetes lithophila 早期雌配子体及晚期胚胎的形态描述［12］、孢子萌发及配子体发育都对环境高度依 赖［13］、I．andicola 的 生 殖 方 式 多 样［14］、I．boliviensis雌配子体中的“分界沟”［15］有着特殊的系统学意义等；在成熟颈卵器形态［16］、精子结构［17］、胚胎特征［18］等领域虽然也有一些深入报道，但都缺乏连续观察，尽管Huang给出了I．taiwanensis颈卵器的发育模式［19］，而Karrfalt则指出I．andicola 颈卵器的形态与生殖无关［14］等。和真蕨类生殖模式日渐明晰［20］、精细生殖结构不断发现［21］相比，水韭类有性生殖的一些基本环节尚不明确或存在争议。

中华水韭（Isoetes sinensis）在长江中下游地区经历了数亿年的生态演化，目前已经近乎灭绝，属国际极危物种（IUCN－CR）［22］，在生殖模式或生殖机制方面，应该有相应的特点。但迄今为止关于生殖的研究还很少，只有刘虹关于大孢子萌发［23］、刘保东关于人工繁殖［24］、邢建娇关于幼苗管护等方面的探讨［25］，分别指出大孢子的萌发率极低、雌配子体容易败育、生殖对环境高度依赖等，路靖［16］就雌配子体及胚胎发育进行了连续切片观察，探讨了中华水韭濒危与生殖障碍的关系，给出了一些系统学观点，但尚不能确定是有性生殖还是孤雌生殖。此外，尚无雄配子体及精子的研究报道。

生殖生理是种群繁衍的基础，生殖结构是物种的溯祖形态［26］，生殖模式反映种群对环境的适应能力［20］。珍稀濒危植物的保护和复壮离不开生殖发育的探索［27］。本实验首次观察中华水韭的雄配子体及精子的发育，明确了有性生殖的基本特征，给出颈卵器的发育模式，指出胚胎发育规律，首次报道叶舌原始细胞发生发育的特征，以期为阐明有关系统学意义、生殖生理及其结构性障碍提供科学依据。

1 材料和方法

1．1 材 料

本实验所用中华水韭的原产地是浙江省华顶山，由浙江大学丁炳扬教授于1999年采集、2001年赠送，凭证标本保存在哈尔滨师范大学植物标本室（HANU），研究用活材料是刘保东通过其孢子繁殖［24］栽 培 在 哈 尔 滨 师 范 大 学 温 室（N45°52′06″，E126°32′59″）的第二代成熟植株。

1．2 方 法

中华水韭的孢子采集与雌配子体培养方法与邢建娇等［25］相同。将发育成熟的小孢子用5% NaCl水溶液消毒4min后充分水洗，及时接种在土壤浸出液半固体培养基上，在培养2～5周内随时镜检，统计雄配子体的发生率，并在倒置显微镜下，用微细管吸取游动精子滴加在发育良好的雌配子体颈卵器处。选取不同发育时期的雌雄配子体及胚胎培养材料，分别用常规的半薄切片法和超薄切片法，切片染色后镜检拍照。半薄切片用甲苯胺蓝染色，采用Olympus－BX53F型显微成像系统拍照；超薄切片法同曹建国［21］，用Tecmal－g2型透射电子显微镜观察拍照。

2 观察结果

2．1 雌雄配子体的发育

在接种小孢子培养后2～5周内，雄配子体发育成熟，发生率小于千分之一。每个雄配子体（图版Ⅰ，1）内发育出4个精细胞和大量的营养物质。精细胞（图版Ⅰ，2）由细长的精核和多条尾鞭型鞭毛构成，精核横切面呈圆柱状，直径约1．2μm，长10～15μm，鞭毛8～12 条，与精核基本等长，呈典型的“9＋2结构”。培养大孢子20～50d，雌配子体发育成熟（图版Ⅰ，3），在孢子壁三裂缝开裂处逐渐发育出多个颈卵器，并着生有几十条管状透明的单细胞假根。颈卵器多数败育，在可育的颈卵器基部自下而上依次有1个卵细胞和2个颈沟细胞，三者共同构成一个球状体（图版Ⅰ，4），卵细胞的体积占球状体的一半，各细胞中都含有丰富的营养物质。在雌配子体发育初期，观察到了串状排列的大量游离核（图版Ⅰ，5），近球状，不均质（图版Ⅰ，6）。

2．2 颈卵器发育

培养大孢子10d后，在大孢子壁三裂缝处开始发育颈卵器。颈卵器的正常发育过程（图1）是原始细胞经平周分裂形成初生颈壁细胞和中央细胞；在初生颈壁细胞分裂为4～8个颈壁细胞时，中央细胞经一次横分裂，形成初生沟细胞和卵细胞；当颈壁细胞由8细胞分裂为16细胞时，初生沟细胞则进行一次横分裂，形成2个颈沟细胞。颈卵器的腹壁则由卵细胞周围的配子体营养细胞转化而来（图版Ⅰ，7～10）。颈壁细胞常出现分裂紊乱现象，即细胞数量常不及16个（图版Ⅰ，8），或排列不规则（图版Ⅰ，7，11～14）。2 个颈沟细胞的大小比例不稳定（图版Ⅰ，7、8、10），在壁细胞之间常出现质地浓密的空隙（图版Ⅰ，8～11）。颈壁细胞的不规则分化或不规则排列，常导致颈沟不通（图版Ⅰ，12～14）。过熟的卵细胞常自然凋亡，颈卵器腹部形成溃败的空腔，溃败物或通过颈沟涌至配子体表面（图版Ⅰ，15）。

2．3 胚胎发育

合子近球形，细胞核中央位，周围的胞质浓稠，核仁清晰（图版Ⅱ，1）。其后合子近颈沟侧的细胞质开始变浓稠（图版Ⅱ，2），细胞形态斜纵向延长（图版Ⅱ，3），并沿短轴方向进行一次细胞分裂（图版Ⅱ，4），分裂面与颈卵器长轴呈约20°夹角（图版Ⅱ，5）。2～4细胞胚胎易于停止分裂而老化（图版Ⅱ，5）。由于子细胞的体积不等（图版Ⅱ，6）或分裂速度不等（图版Ⅱ，7、8），自数十个细胞后，胚胎即出现明显的组织分化，首先是在靠近雌配子体深处的细胞体积变大，胞质变浅，斜向颈卵器端的细胞保持旺盛的分裂能力，首先分化出第一叶原基（图版Ⅱ，9），由于第一叶原基的快速伸长，雌配子体组织也随之延长（图版Ⅱ，10），继续包围并保护着幼胚，直到第一根原基发生、大孢子壁几乎脱落。随着雌配子体营养的不断损耗，在基足与配子体间首先出现了“分界沟”（图版Ⅱ，11）。早在球形胚时期第一叶还没分化的时候，第一叶的叶舌原始细胞就已经出现（图版Ⅱ，7），但直到第一叶顶端变绿、具有光合能力时，第一叶的叶舌才开始发育（图版Ⅱ，12）。

图1 中华水韭颈卵器发育模式Fig．1 Archegonium development mode of I．sinensis

3 讨 论

Bell等［28］指出在真蕨类卵发生过程中，卵细胞和配子体呈越来越分离的状态，石磊等［29］也曾指出在蕨类植物的卵细胞成熟之后，颈沟细胞、腹沟细胞会发生退化，路靖等［16］认为这种分离现象在中华水韭中也有明显体现，就目前所知的蕨类植物包括台湾水韭（I．taiwanensis）［19］，其颈卵器发育都是卵细胞与腹沟细胞为姊妹细胞，2个颈沟细胞为姊妹细胞，即卵细胞与腹沟细胞的关系最近，与颈沟细胞的关系较远。结合以前的研究结果［16］发现，中华水韭的颈卵器发育模式与上述结论存在明显不同，即“腹沟细胞”与颈沟细胞是由一个细胞分裂而来的，本研究认为中华水韭不存在腹沟细胞，即中央细胞不再分裂，而是直接转化为卵细胞，这在云贵水韭（I．yunguiensis）中也有发现。颈卵器既是颈卵器植物胚胎发育的前提条件和基础结构，也是配子生殖或雌雄结合的唯一场所［30］，如果Karrfalt［14］所观察到的水韭胚胎的形成与其颈卵器无关，在理论上这种胚胎应该是不定胚，即由雌配子体的营养细胞经过脱分化和细胞分裂而形成的，因为雌配子体的所有营养细胞与卵细胞具有相同的染色体组，应属于无配子生殖，只是发生的场所不在颈卵器内而已。这从另一个角度证明了水韭类植物的生殖方式具有显著的特殊性。

配子体和颈卵器对胚胎的位置和方向起到决定作用，胚胎发育模式与重力因素关系甚小［12］。本研究观察到中华水韭没有胚柄，合子的第一次分裂方向与I．lithophila［18］基本相同，都出现约20°的夹角，也证实了路靖等［16］的结论，但与北美水韭I．echinospora 合子第一次横裂不同 ，似乎可以认为中华水韭与I．lithophila的亲缘关系可能更近一些。中华水韭胚胎发育显示第一叶不仅早于第一根发生，而且很早就分化出了叶的特征性结构即叶舌（原始细胞），支持Nayar通过孢子体提出的真蕨类植物根叶优先发生学说［32］，也支持通过胚胎发育提出的真蕨类根叶优先发生理论［33－35］，结合卷柏科（Selaginellaceae）胚胎发生［36］和石松科（Lycopodiaceae）胚胎发生［4］的特点，根叶优先发生的观点同样适用于石松类，而且叶的发生为最早。

同样 是 水 生 蕨 类，水 蕨（Ceratopteris thalictroides）的颈卵器发育良好，很容易受精［21］，而中华水韭与系统演化也相对孤立的原始薄囊蕨紫萁属（Osmunda）［37］都较难受精，似乎表明在生殖特殊性与演化孤立性之间存在着某种内在的关系。中华水韭在有性生殖方面的濒危原因可能是：雄配子体发生率极低，雌配子体败育率很高。前者限制了精子的产量，后者导致受精场所的缺失；由于雌配子体的形态结构和发育环节都较为复杂，其败育的限制性因素也多种多样：颈卵器颈壁细胞在数量上和排列位置上都易于紊乱，颈沟不畅通；颈沟细胞生殖辅助功能不完善，容易堵塞受精通道；过熟的卵细胞凋亡后，容易引起雌配子体的局部坏死；雌配子体没有光合同化能力，存活时间短，如果不能及时受精，容易耗尽营养，即使在后期遇到了受精机会，所剩营养物质也不一定能满足胚胎发育的要求。

种子植物雌配子体游离核的形态结构、分裂状态能直接决定配子体是否败育，而且具有稳定的遗传特点［38］，本研究只是首次观察到了中华水韭也有游离核存在，但尚不明确能否继续分裂，游离核与雌配子体育性的关系尚需进一步研究。

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图版Ⅰ 1～6．雌雄配子体的发育：1．透射电镜下的成熟雄配子体纵切面，示精细胞（S）、淀粉粒（ST）和蛋白质（P）；2．透射电镜下的精细胞横切面，示精核（SP）和鞭毛（F）结构；3．光镜下雌配子体顶面观，示孢子壁（SPO）、颈卵器（A）及假根（R）；4．透射电镜下的卵细胞（E）和颈沟细胞（N1，N2）的纵切面；5．透射电镜下雌配子体发育早期的游离核群体；6．透射电镜下的游离核内部结构。7～15．颈卵器发育：7．幼嫩颈卵器纵切面；8．只有2层颈壁细胞的败育颈卵器；9．发育完好的颈卵器，示第一颈沟细胞（N1）、第二颈沟细胞（N2）和卵细胞（E）；10．颈沟细胞与壁细胞间形成空腔并充满浓稠物质，卵细胞（E）发育充分；11．第二颈沟细胞（N2）萎缩；12．第二颈沟细胞（N2）膨胀或分裂；13．败育的颈卵器群；14．分化紊乱的颈卵器；15．败育的颈卵器，示过熟卵细胞崩溃解体。PlateⅠ Fig．1－6．The development of male gametophyte and female gametophyte：Fig．1．Vertical section of mature male gametophyte through the Transmission Electron Microscope，spermatid（S），starch（ST）and protein（P）；Fig．2．Transverse section of spermatid through the Transmission Electron Microscope，sperm nucleus（SP）and flagellum（F）structure；Fig．3．Apical view of female gametophytes through the light microscope，sporoderm（SPO），archegonium（A）and rhizoid（R）；Fig．4．Vertical section of egg（E）and neck canal cells（N1，N2）through the Transmission Electron Microscope；Fig．5．Free nuclei in the early development of female gametophyte，observed by the Transmission Electron Microscope；Fig．6．Internal structure of the free nuclei through the transmission electron microscope．Fig．7－15．The development of archegonium：Fig．7．Vertical section of young archegonium；Fig．8．Abortive archegonium just have two layers of neck wall cell；Fig．9．Development of the archegonium，the first neck canal cell（N1），the second neck canal cell（N2），egg（E）；Fig．10．A cavity between neck canal cell and wall cell and full off thick material，egg（E）is fully develop；Fig．11．The second neck canal cell（N2）is atrophy；Fig．12．The second neck canal cell（N2）expand or division；Fig．13．Abortive archegoniums；Fig．14．Differentiation disorders archegoniums；Fig．15．Abortive archegonium，the egg over mature is collapse and disassemble．

图版Ⅱ 胚胎发育1．受精卵的横切面；2．合子的细胞质发生变化；3．合子斜纵向伸长；4．合子第一次分裂；5．老化败育的2细胞胚胎；6．细胞不等分裂的胚胎；7．胚胎中最早出现的叶舌原始细胞（L）；8．胚胎早期的组织分化；9．基足与第一叶原基的早期发育；10．随幼胚发育而不断纵向延伸的雌配子体；11．雌配子体中出现“分界沟”，幼胚已经分化出第一叶原基（F）和第一根原基（FR）；12．刚开始发育的第一叶的叶舌（LI）。PlateⅡ The development of embryo Fig．1．Transverse section of zygote；Fig．2．Zygote’s cytoplasm is changed；Fig．3．Zygote elongation towards inclined and longitudinal；Fig．4．Zygote division for the first time；Fig．5．Embryos with 2cell is aging and abortive；Fig．6．The embryo cell is unequal division；Fig．7．The earliest appear about the ligule primitive cell（L）in the embryo；Fig．8．Organization differentiation on the early embryo；Fig．9．Basal foot and first leaf primordium early development；Fig．10．Female gametophytes elongation towards longitudinal as the young embryo development；Fig．11．“Gametophyte－sporophyte junction”appeared from the female gametophytes，while young embryo has differentiated the first leaf primordium（F）and the first root primordium（FR）；Fig．12．The first leaf ligule（LI）just starting to develop．