关苍术花粉母细胞减数分裂及其雄配子体发育研究

朴 锦，具红光，朴钟云

（1 延边大学 农学院，吉林延吉133002；2 沈阳农业大学 园艺学院，沈阳110161）

关苍术（AtractylodesjaponicaKoidz.ex Kitam）属菊科苍术属多年生草本植物，主产于中国的东北，是吉林省的道地药材［1］，具有燥湿健胃、祛风湿、明目等功效，能治湿困脾胃、倦怠嗜卧、胸痞腹胀、食欲不振、肢节酸痛、夜盲等疾病［2］。国内外对关苍术的研究主要集中在化学成分［3－4］、药理活性［5］、炮制方法［6］及环境因子的影响［7］等方面，对于关苍术的细胞学研究较少，仅见于王臣［8］、张定成［9］和李俊英［10］的核型分析报道，而关于关苍术花粉母细胞减数分裂方面的研究鲜有报道。因此，本研究对关苍术花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育过程进行细致观察，以期揭示减数分裂过程中染色体变化的行为规律，为关苍术个体世代之间遗传物质的恒定性、遗传变异规律、生殖发育过程等细胞遗传学的深入研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料为菊科苍术属的关苍术，取自延边大学农学院关苍术种质资源圃。

1.2 实验方法

于2014年6月17日早晨6：00～9：00，每隔30 min摘取一次正在生长的不同大小的关苍术花蕾。采集后立即放入卡诺氏固定液（冰乙酸∶无水乙醇＝3∶1）中固定24h，经95%、80%乙醇各浸泡30min，最后转入70%乙醇中，置4℃冰箱保存备用。

制片时取出花蕾，用游标卡尺测量其直径后放在载玻片中央，用解剖针挑出3～5枚花药，滴1～2滴卡宝品红于花药上，用解剖针将花药横向切断，并从一端向切口轻轻挤压花药挤出花粉母细胞，然后用镊子除尽花药壁等杂物，盖上盖玻片。吸除多余染色液后烤片，然后立即用滤纸盖住，用大拇指轻压盖片。镜检并将好的片子用中性树胶封片并摄影。

观察同花蕾和花药中减数分裂进程，并拍照保存；分析花蕾大小与减数分裂进程的关系，并统计减数分裂进程中花粉母细胞内出现异常（如双核仁、落后染色体、染色体桥、染色体片段、微核以及多分体等）情况的频率。

2 结果与分析

2.1 关苍术花蕾形态与减数分裂的关系

关苍术花由许多管状小花构成头状花序，花序外围有一轮叶状苞片，总苞片5～8 层（图1，a、b），花瓣为白色（图1，c），5 枚连合，子房2心皮下位，花柱1条，伸于花药管中，顶端柱头2裂。关苍术两性花、雌花异株，两性花具有聚药雄蕊（图1，d、e），开花后能看见淡紫色的花药，而雌花中则看不到花药，剥除花瓣后即可看到相互分离的花丝和花药，但其花药全部干瘪不产花粉（图1，f）。

减数分裂过程与花蕾直径存在一定相关性，花蕾直径约4～5mm 时，关苍术花粉母细胞进入减数分裂时期，当直径超过约12 mm，减数分裂已基本结束（表1）。同时还发现同一花蕾中不同花药，甚至同一花药内不同花粉母细胞间也存在减数分裂进程的不同步性（图1，g～k）。

2.2 关苍术花粉母细胞减数分裂

共观察前期Ⅰ至四分体时期的1155个细胞，其中异常率为7.71%（表2）。减数分裂各个时期的主要特征如下：

观察处于前期Ⅰ的299 个细胞，减数分裂正常细胞有294个。处于前期Ⅰ的细胞染色体行为具有如下特点：细线期，核内出现细长如线的染色体，相互紧密缠绕位于细胞一侧（图版Ⅰ，1）；偶线期，染色体较细线期缩短增粗，同源染色体开始联会，位于细胞中央（图版Ⅰ，2）；粗线期染色体进一步短缩加粗，1.68%的粗线期细胞出现2个核仁（图版Ⅰ，3、4）；双线期染色体螺旋化，缩短变粗，染色体现出“V”、“X”、“O”型等形状（图版Ⅰ，5）；终变期染色体更加粗短，形成12对较规则的二价体，多以棒状、点状等形式存在（图版Ⅰ，6），此期二价体在核内均匀分散排列，是核内染色体计数的好时期，关苍术染色体构型为2n＝14Ⅱ。

中期Ⅰ，核仁消失，二价体排列在赤道板两侧（图版Ⅰ，7～9），是鉴定染色体数目的最好时期（图版Ⅰ，7），13.34%细胞存在落后染色体（图版Ⅰ，10）。

表1 关苍术减数分裂时期和花蕾直径的关系Table1 The relationship between several periods of meiosis and diameter of floral bud of A.japonica

图1 关苍术花蕾、雄蕊及同一花药不同时期的减数分裂相（标尺＝12μm）Fig.1 Meiosis－related A.japonica buds，stamens and anthers at different times in the same anther（Bar＝12μm）

表2 减数分裂各时期花粉母细胞数量及染色体异常频率Table2 Number and frequency of pollen mother cells in each stage of meiosis

后期Ⅰ，在纺锤丝的牵引下，二价体中的两条同源染色体彼此分离（图版Ⅰ，11、12），随机向两极移动，完成染色体数目减半（图版Ⅰ，13）。此期4.20%的细胞出现染色体桥（图版Ⅰ，14）和落后染色体（图版Ⅰ，15）。

末期Ⅰ，染色体移到细胞两极后，松散变细，逐渐形成两个子核，核仁和核膜重新出现（图版Ⅰ，16）。此期2.42%的细胞存在分裂不同步现象（图版Ⅰ，17）。

前期Ⅱ，染色体散乱分布，逐渐缩短（图版Ⅰ，18）。

中期Ⅱ，两组染色体分别排列在各自的赤道板上（图版Ⅰ，19），4.00%的细胞出现落后染色体（图版Ⅰ，20）或产生染色体不同步的现象（图版Ⅰ，21）。

后期Ⅱ，姊妹染色单体在纺锤丝的作用下分别移向两极（图版Ⅰ，22），其中有81.99%的细胞染色体能正常分向两极，有18.02% 的细胞出现染色体桥（图版Ⅰ，23）或产生染色体不同步的现象（图版Ⅰ，24、25）。

末期Ⅱ，到达两极的四组子染色体解螺旋，浓缩成团，核仁出现，核膜形成，1 个母细胞分裂成4个子细胞（图版Ⅰ，26），至此减数分裂结束，进入四分体时期。

四分体时期，染色体到达四极，解螺旋，形成隔壁分为四分体，其四分体结构少数为十字型或环型（图版Ⅰ，27），多为四面体型（图版Ⅰ，28）。此期表现极为复杂，正常四分体占85.14%，染色体融合（图版Ⅰ，29、30）、三分体（图版Ⅰ，31）、五分体（图版Ⅰ，32）、六 分 体（图 版Ⅰ，33）等 异 常 现 象 共 占14.87%。随后，小孢子相互分离，形成4个单核花粉粒（图版Ⅰ，34），也存在部分花粉粒未能正常发育的现象（图版Ⅰ，35）。

2.3 关苍术雄配子体的发育

关苍术小孢子（单核花粒）初期细胞壁薄，细胞质浓，核位于细胞的中央（图版Ⅱ，a）。单核花粉粒不断从周围吸取绒毡层的分泌物或其降解物，体积增大，柱状结构上沉积孢粉素，形成花粉外壁（图版Ⅱ，b），细胞质明显液泡化，逐渐形成中央大液泡，细胞核被挤向与花粉粒壁的一侧，进入单核靠边期（图版Ⅱ，c、d）；此后，细胞核在近壁处不均等分裂（图版Ⅱ，e），形成不同形状的两个细胞，圆形状靠近液泡的即为营养细胞，弧形状靠近花粉粒壁的为生殖细胞（图版Ⅱ，f、g）；生殖细胞渐渐伸长，呈纺锤形，再进行1次有丝分裂，形成两个精细胞，成为3－细胞型花粉粒（图版Ⅱ，h、i）。关苍术花粉形成外壁时，有些地方没有积累壁物质而留有空隙，这些空隙逐渐发育成萌发沟（图版Ⅱ，g），花粉在柱头上萌发时花粉管即从此处伸出。

3 讨 论

3.1 关苍术花粉母细胞减数分裂观察的最佳时期

关苍术减数分裂的染色体行为在同一花蕾和花药间均表现出不同步性，特别是花蕾外围小花的花药和内部小花的花药间差异明显。这种不同步性可以延长关苍术的花期，避免外部环境（如阴雨、低温）对散粉的影响而增加授粉几率，对其种群繁殖有利，是一种适应环境条件的进化表现［11］。关苍术花粉母细胞减数分裂时期与花蕾大小紧密相关，在花蕾大小为4～12mm 时取样，可初步判断其进入减数分裂时期，若想掌握花药的减数分裂时期，可以此作为取材依据。

3.2 关苍术减数分裂异常的原因及其与花粉败育的关系

3.2.1 染色体桥 后期染色体桥是最常见的染色体异常现象，可以作为鉴定是否出现染色体倒位的依据之一［12］。在关苍术花粉母细胞减数分裂的后期Ⅰ和后期Ⅱ均产生染色体单体桥，其原因可能是在倒位圈内外，非姊妹染色单体之间发生交换，其结果产生双着丝点染色单体。此双着丝粒在后期向相反的两级移动时，两个着丝粒之间的区段跨越两级构成后期桥。凡是含有因交换而产生重复－缺失染色体的四分孢子都是败育的，因此，关苍术也存在花粉部分败育的现象。

3.2.2 落后染色体 关苍术染色体制片中还发现染色体小片段和落后染色体。落后染色体是由于分裂的细胞受到损伤（多半是由于纺锤体被破坏），引起染色体不同步移动或者不移动而造成的，本试验中多见于分裂中期Ⅱ和后期Ⅱ，这种现象有可能导致关苍术染色体数目的丢失从而造成部分花粉的败育。

3.2.3 不均等分离 正常进入减数分裂的细胞在四分体时期有明显的四个均大的小孢子，被胼胝质壁所包裹，而异常的小孢子母细胞在形成四分体时产生不均等分离而产生三分体、五分体或多分体。这种不均等分离的原因可能有以下原因，一是有的二价体不发生分离，移向同一级；二是单价体的随机分配；三是发生倒位的双着丝点染色体被拉向同一级。不均等分离引起的遗传物质的减少或增加最终导致配子体不育［13］。

3.2.4 减数分裂不同步 关苍术花粉母细胞的减数分裂末期Ⅰ和中期Ⅱ到达两级的染色体发生不同步的现象，其原因可能是部分花粉母细胞在减数分裂某一时期发生停滞或推迟造成的，花粉母细胞发育虽不同步，但最后均完成减数分裂形成花粉粒。刘丽琴［14］等也认为减数分裂过程中发生的染色体桥、落后染色体、染色体片段及多分孢子等异常现象与减数分裂的不同步没有直接的关系。

减数分裂过程中发生的染色体桥、落后染色体、染色体片段及多分孢子等异常现象，会不同程度地导致小孢子中遗传物质的不均衡而形成没有育性的

孢子，是造成花粉育性低的重要原因［15］。我们曾采用蔗糖培养法对关苍术花粉的育性检测，发现蔗糖浓度为15%，培养温度25℃时，败育率为19.6%［16］，其花粉败育率和减数分裂后期的异常行为比率接近，说明花粉败育应该有一定的细胞学原因。导致花粉败育的原因是多方面的，除了细胞学原因，还可能与绒毡层细胞的作用失常、营养不良及外界环境等有关，具体原因有待于进一步研究。

图版Ⅰ 关苍术（两性花）花粉母细胞减数分裂及异常情况（标尺＝12μm）PlateⅠ The Meiosis process of pollen mother cells and abnormal conditions of A.japonica（bisexual flower）（Bar＝12μm）

图版Ⅱ 关苍术花粉粒发育过程（标尺＝12μm）PlateⅡ Microdiode development of A.japonica（Bar＝12μm）

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