HPLC法测定Mucor sp.产肉桂酸降解酶的活性和动力学分析

莫凤萍，马 丽，刘雄民

（广西大学化学化工学院，广西南宁 530004）

HPLC法测定Mucor sp.产肉桂酸降解酶的活性和动力学分析

莫凤萍，马 丽，刘雄民

（广西大学化学化工学院，广西南宁 530004）

建立了高效液相色谱法测定肉桂酸降解酶活性的方法。以肉桂酸为底物、苯乙酮为探针，通过测定苯乙酮的生成速率来计算酶活并进行酶催化动力学分析。色谱柱为Hypersil ODS2柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温为30℃，流动相为乙腈∶水∶冰乙酸＝50∶50∶0.5（体积比），流速为1.0mL·min－1，检测波长为247nm。苯乙酮的线性范围为1.952～156.2μg·mL－1，回收率为99.46%～101.2%，RSD≤1%，检出限为0.45μg·mL－1（S/N＝3）。结果表明，该方法稳定可靠，简便，重复性好，不受杂质干扰，可用于肉桂酸降解酶的活性测定和动力学分析。粗酶液和不同浓度的肉桂酸在30℃下反应2h后，HPLC法测定初反应速率，以双倒数作图法计算酶动力学参数，双倒数图呈直线，符合米氏方程规律，米氏常数Km＝0.07g·L－1，即0.473μmol·L－1，Vmax＝0.058μmol·min－1·mg－1。

HPLC；酶活；肉桂酸；苯乙酮；动力学分析

天然的香精香料是高附加值的食品添加剂和精细化工产品，利用生物催化转化天然前体是一种获得天然香精香料的有效途径，目前已成为国内外的研究热点［1］。肉桂酸是广西特色林产资源，是桂油生产过程中的副产物［2］，本课题组在前期研究中首次筛选到的菌株Mucorsp.能将肉桂酸转化为高附加值的天然香料苯乙酮［3－5］。前期的研究重点主要集中在发酵工艺的优化，对催化该反应的相关酶的酶学性质尚未开展研究。微生物细胞催化作用的实质是酶促反应，酶活力（酶活）是衡量酶生物活性及含量的重要指标［6］，因此，建立适用于肉桂酸降解酶酶活检测方法，为进一步开展肉桂酸降解酶酶学性质和催化机理研究奠定分析基础，是十分迫切和必要的。

目前，用于测定酶活的方法主要有比色法、滴定法、紫外分光光度法、酶偶联法、高效液相色谱（HPLC）法［6－8］，其中高效液相色谱法由于具有灵敏度高、稳定性好、抗干扰性强等优点而得到广泛应用［912］，适用于酶催化动力学分析［13－14］。作者以苯乙酮为探针，用高效液相色谱法测定肉桂酸降解酶的酶活，拟为肉桂酸降解酶的深入研究奠定方法学基础。

1 实验

1.1 菌株、试剂与仪器

毛霉菌Mucorsp.，自行保存。

乙腈，色谱纯，Merck公司；肉桂酸和苯乙酮标准品，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯。

LC-20AT型泵；SPD-10A型UV-Vis检测器，日本Shimadzu公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取苯乙酮标准品适量，以乙醇为溶剂，配制成0.3904g·L－1的标准溶液，4℃储存，备用。

1.3 样品处理

1.3.1 粗酶液的制备

将菌株接种于200mL液体培养基中，按一定的培养条件进行培养，得到发酵液，再将发酵液离心，上清液即为粗酶液。

1.3.2 样品的制备

将5mL粗酶液加入到2.5mL含有0.6g·L－1肉桂酸的磷酸盐缓冲溶液（pH＝7.0）中，于30℃下静置反应2h，取1mL反应液加入0.2mL75%乙醇猝灭反应，4 200r·min－1离心20min，0.45μm微滤膜过滤，HPLC进样分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱温30℃；流动相：乙腈∶水∶冰乙酸＝50∶50∶0.5（体积比）；流速1.0mL·min－1；检测波长247 nm；进样量5μL。

1.5 酶活定义

酶活定义：每分钟生成1μmol苯乙酮为一个酶活单位（U）。

1.6 酶催化动力学分析

图1 不同样品的HPLC图谱Fig.1 HPLC Chromatograms of different samples

取6份1mL粗酶液，分别加入0.5mL含有肉桂酸的磷酸盐缓冲溶液（pH＝7.0），最终底物肉桂酸浓度（g·L－1）分别为0.05、0.08、0.10、0.12、0.15、0.20，于30℃下反应2h后取1mL反应液加0.2mL 75%乙醇猝灭反应，4 200r·min－1离心20min，0.45 μm微滤膜过滤，HPLC进样分析，分别测定30～120 min的初反应速率。

2 结果与讨论

2.1 专属性实验

图1为选定的色谱条件下粗酶液、肉桂酸和苯乙酮标准品混合液、粗酶液加苯乙酮、粗酶液反应样品的色谱图。

由图1可知：在实验条件下，检测到粗酶液有大量的小分子物质，但都在3.5min前出峰，对产物苯乙酮的测定没有干扰，表明方法的专属性好。

2.2 标准曲线和检出限

将苯乙酮标准溶液浓度稀释至1.952～156.2μg ·mL－1，按照色谱条件，以苯乙酮峰面积（y）对浓度（x）进行线性回归。结果表明，在此浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为y＝15017x＋4482.6，相关系数R＝0.9997，检出限为0.45μg· mL－1（S/N＝3），线性关系满足定量要求。

2.3 精密度实验

取一定浓度的苯乙酮标准溶液加入到酶反应体系后，立即用75%乙醇猝灭反应，4 200r·min－1离心20 min，0.45μm微滤膜过滤，在上述色谱条件下，重复进样6次进行方法精密度的测定，RSD＝1%，表明方法的精密度良好。

2.4 稳定性实验

取粗酶液反应样品，室温下放置，分别于0h、2h、 4h、6h、8h、10h、12h在上述色谱条件下进样5μL，结果表明在12h内比较稳定，RSD为1.2%。

2.5 回收率实验

取低、中、高浓度的苯乙酮标准溶液加入到失活的酶反应体系，按1.3.2方法处理样品，在上述色谱条件下测定，并计算加标回收率、RSD，结果见表1。

2.6 粗酶液酶活的测定

微生物的生长会影响酶的合成和分泌，每一种菌株都有一个最适发酵时间，在这个时间产酶量最高，而后随着菌株衰亡，产酶量下降。为找到最适发酵时间，分别取发酵48h、60h、72h、96h、108h的粗酶液，按1.3.2方法处理，测定酶活，结果见表2。

表2 不同发酵时间粗酶液酶活的测定（n＝3）Tab.2 Determination of enzyme activity at different fermentation time（n＝3）

由表2可知，菌株发酵96h，酶活达到最大，为0.0070U·mL－1。

2.7 肉桂酸的酶反应动力学

2.7.1 反应时间的确定

取相同体积的粗酶液，按1.3.2方法处理，分别反应20min、30min、40min、50min、120min、180min、220min，测定苯乙酮的生成量，结果见图2。

图2 苯乙酮生成量与反应时间的关系Fig.2 Plot of acetophenone production vs reaction time

由图2可知，由于酶和底物需要一个接触适应的过程，在前30min几乎不生成苯乙酮，在30～220min内苯乙酮生成量和时间呈线性关系，为了减小测量误差及节约时间，选择测定初反应速率的反应时间为30～120min。

2.7.2 苯乙酮生成量与蛋白浓度的关系

取不同蛋白浓度的粗酶液，按1.3.2方法处理，苯乙酮生成量与粗酶液蛋白浓度的关系如图3所示。

由图3可知，蛋白浓度在0～0.0396g·L－1的范围内苯乙酮生成量和蛋白浓度呈良好的线性关系。表明，在0～0.0396g·L－1浓度范围内的粗酶液适合用于酶动力学分析。

2.7.3 肉桂酸降解酶催化动力学参数

图3 苯乙酮生成量与蛋白浓度的关系Fig.3 Plot of acetophenone production vs protein concentration

按照1.6方法，在选定的考察条件下，测得各底物浓度下的30～120min的初反应速率（V）。底物浓度（［S］）、初反应速率及它们的倒数数据如表3所示。

表3 底物浓度与对应的初反应速率数据Tab.3 The data of substrate concentration and the corresponding initial reaction rate

将浓度和初反应速率利用Lineweaver-Burk法双倒数作图求Km和Vmax，见图4。

图4 1/V与1/［S］的关系Fig.4 The relationship between 1/Vand 1/［S］

3 结论

采用高效液相色谱法，以肉桂酸为底物、苯乙酮为探针，测定肉桂酸降解酶酶活。色谱柱为Hypersil ODS2柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈∶水∶冰乙酸＝50∶50∶0.5（体积比），流速为1.0mL ·min－1，检测波长为247nm，柱温为30℃。苯乙酮的线性范围为1.952～156.2μg·mL－1，回收率为99.46%～101.2%，RSD＜1%，检出限为0.45μg· mL－1（S/N＝3）。表明该方法稳定可靠，简便，重复性好，不受杂质干扰，可用于酶活测定和动力学分析。粗酶液和不同浓度的肉桂酸在30℃下反应2h后，HPLC法测定初反应速率，以双倒数作图法计算酶动力学参数，双倒数图呈直线，符合米氏方程规律，米氏常数Km＝0.07g·L－1，即0.473μmol·L－1，Vmax＝0.058μmol·min－1·mg－1。为进一步系统研究肉桂酸降解酶奠定了方法学基础。

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Activity Determination of Cinnamic Acid Degradation Enzyme Produced by Mucor sp.by HPLC and Study on Its Kinetics

MO Feng－ping，MA Li，LIU Xiong-min
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning530004，China）

A method for determination of cinnamic acid degradation enzyme activity by HPLC was developed.Using cinnamic acid as substrate and acetophenone as probe，the cinnamic acid degradation enzyme activity was calculated and its enzyme kinetics was analysed by determination of the production rate of acetophenone.Hypersil ODS2column（250mm×4.6mm，5μm）was selected at 30℃，with acetonitrile-water-glacial acetic acid（50∶50∶0.5，volume ratio）as mobile phase at flow rate of 1.0mL·min－1，and the detection wavelength was 247nm.The linear range of acetophenone was 1.952～156.2μg·mL－1.The average recovery of acetophenone was 99.46%～101.2%with RSD＜1%.The detection limit was 0.45μg·mL－1（S/N＝3）.This method was proved to be reliable，simple and good reproducible，especially with strong anti-interference，which can be applied to determination of cinnamic acid degradation enzyme activity and kinetic analysis.Different concentrations of cinnamic acid reacted with enzyme at 30℃for 2h，initial reaction rate was determined by HPLC.Enzyme kinetics parameters were calculated by double inverse method，Double inverse graph was a straight line which conformed to the law of Michaelic-Menton equation，Km＝0.07g·L－1（0.473μmol·L－1），Vmax＝0.058 μmol·min－1·mg－1.

HPLC；enzyme activity；cinnamic acid；acetophenone；kinetic analysis

O 657.72

A

1672-5425（2015）03-0062-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.03.016

广西教育厅资助项目（2013ZL006）

2014-12-16

莫凤萍（1988－），女，广西桂林人，硕士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：315214713＠qq.com；通讯作者：马丽，高级工程师，E-mail：gxumali＠126.com。