金钱草不同部分对草酸钙结石小鼠肾脏骨桥蛋白表达的影响

李 静，梁 圆，李立顺，时维静，贺绍君，刘德义

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

金钱草不同部分对草酸钙结石小鼠肾脏骨桥蛋白表达的影响

李 静，梁 圆，李立顺，时维静，贺绍君，刘德义

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

目的：研究金钱草不同部分对草酸钙结石小鼠肾脏功能及其对肾脏组织中骨桥蛋白(OPN) 免疫印迹表达的影响。方法：小鼠给予含1% 乙二醇和1% 氯化铵的饮水，造成小鼠草酸钙结石模型，同时分别给予金钱草石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水相部分提取物，试验期42天，试验结束时，测定血清中尿酸、尿素氮和肌酐的含量，采用免疫印迹法(Western blotting)测定肾组织OPN蛋白表达水平。结果:各组小鼠血清中的尿酸含量差异均不显著；结石组尿素氮含量极显著高于对照组，金钱草氯仿、乙酸乙酯、正丁醇组尿素氮含量极显著低于结石组；结石组肌酐含量极显著高于金钱草石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相组；结石组肾组织中的OPN的表达显著高于对照组，金钱草氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相组的OPN的表达均显著低于结石组。结论：金钱草的氯仿、乙酸乙酯和水相组分可降低结石小鼠血清中尿素氮和肌酐的含量，增强肾脏的代谢能力，金钱草氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相组均能降低肾组织中的OPN的表达，产生抑制草酸结石的效果。

金钱草；草酸钙结石；尿酸；尿素氮；肌酐；骨桥蛋白

金钱草正品在《中国药典》中记录的是报春花科(Primulaceae) 珍珠菜属植物过路黄(Lysimachia Christinae Hance)的干燥全草，主要功效为利尿排石，清热解毒，活血散瘀[1]，在临床应用中广泛做为治疗肾结石的经典中药，能酸化尿液，对膀胱和输尿管平滑肌有扩张作用，可通过增加尿量以增加肾盂和输尿管内压，从而发挥排石作用[2]。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种磷酸化糖蛋白，富含天冬氨酸，OPN是肾结石的有机基质成份之一，结石动物模型中OPN的表达明显增加[3]，实验表明其在体外能抑制草酸钙晶体的成核、聚集，减少草酸钙晶体与肾小管上皮细胞的粘附，由此推断OPN可能是草酸钙结石的抑制因子[4]，本试验采用1%氯化铵和1%乙二醇混合溶液诱发小鼠形成草酸结石，同时采用金钱草不同溶剂的萃取部分进行干预，分别是金钱草石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水相部分，试验42d，采血，制备血清，测定尿酸、尿素氮和肌酐的水平，用免疫印迹法观察各组小鼠肾OPN表达的水平，为探讨金钱草抑制肾草酸钙结石形成的有效主成分研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 金钱草不同部分的萃取与制备

金钱草，安徽济人药业有限公司，产地：四川，批号：20130111，经安徽科技学院食品药品学院时维静教授鉴定为正品。提取方法：金钱草，称重，干燥，粉碎成粗粉10 目，加水30 倍，加热回流提取2 次，合并滤液，放置沉淀24 h，取上清液，水浴浓缩，置分流漏斗，加石油醚充分摇匀后放置分层，重复两次，取石油醚层，水浴蒸干，置干燥箱60 ℃干燥，刮取浸膏粉为“金钱草石油醚部分”；水层加氯仿萃取得“氯仿部分”、水层加水饱和的乙酸乙酯萃取得“金钱草乙酸乙酯部分”；水层加水饱和的正丁醇萃取得“金钱草正丁醇部分”；剩余水相蒸干为“金钱草水相”。置-20 ℃冰箱内密闭保存。本试验中，50 g金钱草用水煎煮得干浸膏7.015 g，得率为14.03%，其不同萃取部分得率分别为：石油醚0.013%、氯仿1.57%、乙酸乙酯12.06%、正丁醇1.75%、水相21.42%。

1.2 草酸钙成石液的配制

氯化铵，批号：20130122，乙二醇，批号：20130705，均为天津市永大化学试剂有限公司生产，分析纯。按参考文献[5]中的方法配制草酸钙成石诱导液：其比例为：氯化铵10 g，乙二醇10 mL，蒸馏水定容至1L。

1.3 小鼠的分组

140只SPF级昆明小鼠，60日龄，雄性，由安徽省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(皖)2011-002。饲喂汤山龙泉牌实验鼠颗粒饲料。适应性饲养1w，分7组。金钱草不同部分提取物的处理：石油醚部分和氯仿部分加适量95%乙醇溶解，再加蒸馏水稀释，乙醇终浓度≤2%，其余部分用蒸馏水稀释，最终稀释到1 ml药液等同于1 g生药中的提取物。对照组饮用蒸馏水，其余组别均饮用质量浓度1%氯化铵与体积分数1%乙二醇的混合溶液，对照组和结石组给予灌胃生理盐水10 mL/kg·d，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相组分别灌胃相应的金钱草提取物10 mL/kg·d，给药周期42 d。试验结束时，采血，测定血清中尿酸、肌酐和尿素氮水平，剖杀小鼠，取肾脏，-70 ℃保存，检测OPN蛋白的表达水平。南京建成生物工程研究所生产试剂盒：尿酸试剂盒，肌酐试剂盒，血尿素氮(BUN)测试盒，批号均为：20140415。

1.4 Western blotting检测肾组织OPN蛋白的表达

匀浆器处理肾组织，用预冷的PBS洗2遍，加入5倍体积的组织蛋白裂解液，置冰中30 min，离心，取上清液，测蛋白浓度。行 SDS-PAGE 电泳。电泳后转聚偏二氟乙烯膜( PVDF 膜) ，浸泡于含1∶1 000稀释的兔抗人OPN多克隆抗体(英国Abcam公司) 封闭液中，4 ℃过夜孵育，加入1∶3 000稀释的HRP标记羊抗兔二抗(Jackson Immun公司)，室温孵育1 h，最后在暗室中进行化学发光法显影，保存图片。Quantity One 4.4.0软件分析Western blotting成像图谱，计算OPN与β-actin灰度值的比值。

1.5 数据统计分析

数据均采用均数±标准差(M±SD)表示。用SPSS19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 宰前体重和肾体比的变化

表1 各组小鼠宰前体重和肾体比的比较

注：与对照组比较，a表示P<0.05，A表示P<0.01；与结石组比较，b表示P<0.05，B表示P<0.01，下同。

Note: that compared with the normal control group, a:P<0.05, A:P<0.01, that compared with the Oxalate Calcium Stone group, b:P<0.05, B:P<0.01, the same below.

表1数据显示，结石组肾体比略高于对照组，但差异不显著，无统计学比较意义，但结石组的肾体比最高，可能与金钱草各组分的溶石排石作用有关。与对照组相比，其余各组小鼠体重都有所下降，可能是由于成石液对消化道粘膜的刺激和肾组织的损伤所导致。

2.2 金钱草不同部分对结石小鼠血清尿酸、尿素氮和肌酐的影响

表2 各组小鼠血清尿酸、尿素氮和肌酐的比较

表2显示，各组尿酸含量差异均不显著；结石组尿素氮均数比对照组高1.53mmol/L(P<0.01)，与结石组相比，氯仿、乙酸乙酯、水相组的尿素氮的均数分别降低0.56mmol/L(P<0.01)、0.67mmol/L(P<0.01)、0.57mmol/L(P<0.01)；金钱草不同部分各组的肌酐均极显著低于结石组。

2.3 金钱草不同组分对结石小鼠肾脏骨桥蛋白Western blotting表达的影响

Western blotting结果显示，OPN的分子量约为44 kDa，结石组大鼠肾组织OPN蛋白显著高于对照组，金钱草乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、水相组OPN均显著低于结石组，见图1和表3。

对照组Controlgroup结石组Stonegroup石油醚组Partofpetroleumether氯仿组Partofchloroform乙酸乙酯组Partofethylacetate正丁醇组Partofn-butanol水相组PartofwaterOPN/β-actinratiosofOPN/β-actin0.50±0.05b0.90±0.15a0.88±0.07a0.59±0.14b0.70±0.08ab0.61±0.09b0.59±0.07b

3 讨论

3.1 草酸钙结石小鼠模型的建立以及成石液对小鼠的影响

氯化铵可酸化尿液，乙二醇可转化为草酸，二者协同可形成泌尿系统的草酸钙结晶[6]。成石组小鼠宰前活重较对照组有所降低，但差异不显著。试验期间，对照组小鼠抓捕应激反应强烈，其余组小鼠的精神状态较差，毛色发黄，造成此现象的主要原因可能是成石液和各干预组药液对小鼠的胃黏膜以及肾脏刺激的作用，使得小鼠的精神状态较差。成石组肾体比最高，主要原因可能是钙结晶在成石组小鼠肾中附着和沉积，也可能与成石液对尿路造成的炎症损伤有关。

3.2 金钱草不同部分对结石小鼠血清尿酸、尿素氮和肌酐的影响

尿酸是体内嘌呤类化合物的最终代谢产物，并通过肾脏排泄，尿酸水溶性差，浓度过高则有结晶析出[7]。本试验中尿酸水平差异不显著，说明金钱草的各部分均不影响草酸结石小鼠的尿酸代谢。血清中尿素氮的浓度受到多种因素的影响，急性慢性肾小球肾炎、肾功能障碍可能会引起血液中尿素氮的增高，泌尿系结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤等均可能使血液中尿素氮增高[8]，本试验中成石组尿素氮极显著高于对照组，表明结石小鼠体内有尿素氮的蓄积，有肾脏的损伤，氯仿、乙酸乙酯和水相组尿素氮显著降低，说明金钱草氯仿、乙酸乙酯和水相组分的利水护肾作用能够增强肾脏的代谢能力，可以较有效地降低草酸钙结石对肾脏实质细胞和功能的损伤程度。体内肌酐由肌酸脱水而生成，是不可逆反应，肌酐只能经肾小管排泄，但不被肾小管重吸收。临床上测定肌酐含量主要用于检测和鉴定肾脏功能是否处于潜在的衰竭状态或处于改善状态。本试验结果显示金钱草的不同部分组的血清肌酐含量较结石组极显著降低，可能是由于金钱草各组分的利尿作用加强了肾脏的排泄能力，导致肌酐大量外排而造成。

3.3 金钱草不同部分对结石小鼠肾组织中OPN的影响

OPN是带负电荷的富含唾液酸的多功能磷酸化糖蛋白，其相对分子质量约为50 000 kDa左右。免疫组化和原位杂交证实OPN是由肾脏远曲小管和集合管合成分泌[9]。OPN是尿液中草酸钙结晶的强抑制物[10]，也是结石的有机基质成分之一。肾脏OPN的表达强度与尿液抑制晶体结晶的能力有关[11]，但OPN可因生理和病理的状态不同对结晶起双向调节作用，正常条件下，尿液中的OPN覆盖在晶体表面，阻断草酸钙晶体与肾小管上皮细胞的结合，可提高结晶形成所需的草酸钙浓度，从而抑制草酸钙结晶的成核，生长和聚集[12]；而当肾小管上皮细胞损伤时，细胞基底表面的整合素外翻，与草酸钙结晶粘附的OPN结合，形成结石的生成位点，促使草酸钙晶体成核、生长、聚集，生成结石[13]。正常生理情况下，OPN在多种浓度下均对草酸钙结晶的生长和聚集有明显的抑制作用[14]，表明OPN是正常机体中抑制结石形成的内源性大分子物质之一。欧善际[15]研究体外培养大鼠肾小管上皮细胞受1、3、5 mmol/L 一水草酸钙(COM)刺激后，OPN随浓度升高表达增强，但10mmol/L高浓度 COM使OPN表达减弱，提示高浓度 COM 通过损伤肾小管上皮细胞使 OPN 表达下降而形成结石。本试验中结石组OPN表达高于对照组，OPN的过高表达是由于氯化铵和乙二醇灌胃后诱导产生高草酸尿、高钙尿以及草酸钙晶体在肾脏的沉积共同调控所致，提示肾组织病变可增加OPN的表达和结石沉积，而金钱草提取物各组OPN表达量明显下降，提示金钱草提取物可能通过减轻肾病变程度，降低OPN的表达，从而抑制肾脏草酸钙结晶沉积。本试验中结石组OPN表达高于对照组，与以下相关报导结果相一致。米其武[16]等研究表明，用乙二醇和1α-羟基维生素D3灌胃而形成的草酸钙肾结石大鼠模型中，肾小管细胞中OPNmRNA表达明显增强。Yasui[17]等的研究发现，结石模型组大鼠OPN的表达明显高于对照组，米军[18]研究发现结石模型大鼠肾组织和尿液中OPN均明显上升，550、1 100 mg/kg剂量金钱草干预组OPN水平均出现下调。蔡华芳[19]等观察金钱草提取物抑制大鼠肾结石的作用，结果表明肾结石模型大鼠肾脏免疫组化强染色，OPN免疫组化评分明显增加(P<0.001)，提示OPN表达量显著增多，金钱草提取物各组与模型组比较，染色强度较弱，OPN免疫组化评分明显降低，提示金钱草提取物抑制肾脏OPN 的表达，从而抑制脏草酸钙结晶的沉积，作用强度依次为水溶性部分>乙酸乙酷部分>正丁醇部分>醇提取物>石油醚部分。

4 结论

金钱草含有甾醇、黄酮类、甙、多糖、氨基酸、鞣质、挥发油、胆碱、内脂、氯化钾等多种化学成分[20]，相互之间作用较复杂，其黄酮类和多糖类对溶石和排石起主要作用[21]，但金钱草防治泌尿系统结石不仅仅取决于某种单一成分，可能是其多种成分从多方面、多靶点协同发挥作用。本试验研究发现，金钱草氯仿、乙酸乙酯和水相组分可能通过降低结石小鼠血清中尿素氮和肌酐的含量增强肾脏的代谢能力，金钱草氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相组可能通过降低肾组织中的OPN的表达，产生抑制草酸结石的效果。金钱草防治草酸结石的具体机制还有待进一步研究。

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( 责任编辑:窦鹏)

Effects of Active Fraction ofLysimachiaChristinaeHanceon Osteopontin Expression in Renal Tissue of Urolithiasis Mice with Calcium Oxalate Stone

LI Jing, LIANG Yuan, LI Li-shun, SHI Wei-jing, HE Shao-jun, LIU De-yi

(College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective:To investigate the intervention effect ofLysimachiaChristinaeHanceextracts on renal function and osteopontin expression by Western blot in calcium oxalate Stones mice. Method:The mice with calcium oxalate stone formation were induced by 1% ethylene glycol and 1% ammonium chloride, meanwhile extracts ofLysimachiaChristinaeHancewere given, which are part of petroleum, part of chloroform, part of ethyl acetate, part of n-butanol, and part of water. The test period is 42 days. At the end of the experiment, the content determination of serum uric acid, urea nitrogen and creatinine,are measured determination of OPN protein expression in renal tissue level is assessed by Western blot. Results:The difference of serum levels of uric acid content were not significant, urea nitrogen content oxalate calcium stone ware significantly higher than that in the control group, urea nitrogen content of part of chloroform, part of ethyl acetate, part of n-butanol were significantly lower than oxalate calcium stone group, creatinine content oxalate calcium stone was significantly higher than that part of petroleum, part of chloroform, part of ethyl acetate, part of n-butanol, part of water. The expression of kidney stones in the OPN oxalate calcium stone group was significantly higher than that in control group, the OPN of part of chloroform, part of ethyl acetate, part of n-butanol, part of water is significantly lower than the stone group. Conclusion The component of chloroform, ethyl acetate and water fromLysimachiaChristinaeHancecan reduce the content of urea nitrogen and creatinine stones in serum of mice, enhance the metabolism of kidney, the expression of chloroform, ethyl acetate, n-butanol and water ofLysimachiaChristinaeHancecanreducerenaltissuesofOPN,inhibittheeffectofoxalatestones.

LysimachiaChristinaeHance; Calcium oxalate stones; Uric acid; Urea nitrogen; Creatinine; Osteopontin

2014-12-11

安徽科技学院自然科学研究项目(ZRC2013366);安徽省第七批115团队项目;安徽省大学生创新创业训练计划项目(AH201310879074)。

李静(1979-)，女，黑龙江省齐齐哈尔市人，博士,副教授，主要从事中草药防治动物疾病研究。

S853.72

A

1673-8772(2015)02-0001-05