硫氧还原蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义

陈小燕，刘琴，兰康云，王珊，刘斌，王辉

硫氧还原蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义

陈小燕，刘琴，兰康云，王珊，刘斌，王辉

目的探讨硫氧还原蛋白(Srx)在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学SABC法检测104例宫颈鳞癌组织及其相应癌旁组织、15例重度子宫颈上皮内瘤变(CIN Ⅲ)组织及20例正常宫颈上皮组织中Srx的表达情况，并分析其表达情况与宫颈鳞癌临床病理特征的关系。结果Srx在CIN Ⅲ及宫颈鳞癌组织中的阳性率分别为73.3%(11/15)、82.7%(86/104)，明显高于正常宫颈组织[35.0%(7/20)]，差异有统计学意义(χ2=17.778，P=0.000)。Srx在癌组织中的表达明显高于其癌旁正常宫颈组织(χ2=56.224，P=0.000)。宫颈鳞癌组织中Srx的表达与淋巴结转移、肿瘤浸润深度及有无脉管浸润有关(P<0.05)，而与患者年龄、临床分期、肿瘤大小及癌组织分化程度无关(P>0.05)。结论Srx在宫颈鳞癌组织中高表达，有可能作为宫颈鳞癌早期诊断及预后评估的一个有价值的指标。

硫氧还原蛋白；宫颈肿瘤；免疫组织化学

宫颈癌(cervical cancer)是全球最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一[1]，我国宫颈癌的发生率占女性生殖道恶性肿瘤的第一位[2]。宫颈癌的组织学类型以宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma)为主，占75%～80%，其侵袭和转移常常是影响患者预后的主要因素。因此，通过对肿瘤的基础及临床研究，筛选预测宫颈癌发病风险的生物学标记物[3-4]，寻找靶向治疗方法，以期延长肿瘤患者的生存时间及提高治愈率，已成为当前肿瘤研究的一个重要方向。硫氧还原蛋白(sulfiredoxin，Srx)是真核生物中一类高度保守的低分子量(Mr=13 000)的含硫蛋白质[5]，主要由氧化应激诱导产生，其功能是维持细胞内的氧化还原平衡。Srx可调节一系列的活性氧信号并参与细胞中的多条信号通路，从而影响肿瘤的发生和发展。研究表明，与正常组织相比，Srx在皮肤癌、肺癌等多种肿瘤组织中的表达明显升高[6-7]。但Srx在宫颈癌组织中的研究尚未见报道。本研究通过免疫组织化学SABC法检测Srx在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变(CIN Ⅲ)及宫颈鳞癌中的表达，以探讨其在宫颈鳞癌浸润和转移中的作用及其临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年1月－2015年1月重庆医科大学病理诊断中心存档的宫颈组织蜡块标本139例，其中宫颈鳞癌104例、CIN Ⅲ 15例、正常宫颈20例，疾病诊断均经病理证实。104例宫颈鳞癌患者在手术前均未接受过任何化疗及其他方式的治疗，患者年龄45.5±9.0(30～74)岁，按照2009年国际妇产科联盟(FIGO)标准分期：Ⅰ期92例，Ⅱ期12例。组织分化程度：高分化12例，中分化62例，低分化30例；有盆腔淋巴结转移16例，无盆腔淋巴结转移88例；原发灶≥4cm 25例，<4cm 79例；有脉管浸润15例，无脉管浸润89例；肌层浸润深度≥1/2肌层48例，<1/2肌层56例。正常宫颈组织蜡块来自同期因妇科良性疾病手术治疗的患者。

1.2 主要试剂 山羊抗人Srx多克隆抗体(购自Genetex公司，稀释比例1:200)，免疫组化试剂盒(购自Boster公司，SABC法)，浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 实验方法 蜡块连续4µm切片，免疫组织化学SABC法严格按试剂盒操作说明进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照为已知阳性片。组织切片经60℃恒温箱中烤片1h后常规脱蜡至水，PBS缓冲液振洗5min×3次；抗原修复方法为将切片置于枸橼酸盐缓冲液中，经微波炉中高火煮沸5min×3次，待自然冷却至室温；PBS振洗后加适当H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶活性，37℃孵育15min；PBS充分振洗，加正常兔血清封闭液37℃孵育30min；加1:200稀释的一抗，4℃孵育过夜；PBS缓冲液振洗5min×4次；加生物素标记的二抗，37℃孵育20min；PBS缓冲液振洗5min×4次；加试剂SABC，37℃孵育20min；PBS缓冲液振洗5min×4次；DAB显色，苏木素染核，盐酸乙醇分化，饱和碳酸锂返蓝，脱水，封固，镜检。

1.4 结果判定标准 Srx阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，呈浅黄色、黄色或棕黄色颗粒。免疫组化染色结果均由2名高年资病理医生在不知病例资料的情况下盲法阅片，对每张切片至少在高倍镜(×400)下观察5个不重复视野来判断结果。按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分(immunohistochemical scores，IHS)[8]：①切片染色对比度好，背景清晰；②阳性细胞定位要准确；③出血、坏死、受挤压的组织及切片边缘不应作为判断依据。在符合这3个基本条件的前提下，采用以下标准进行判断。首先对染色强度计分：无色计0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分(染色深浅需与背景着色相对比)。再按阳性细胞所占的百分比计分：阴性计0分，阳性细胞≤10%计l分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，>80%计4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积共0～12分，0分判定阴性(–)，1～3可疑阳性(+)，4～12判定阳性，其中4～8分阳性，9～12分强阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计数资料采用率表示，组间比较采用四格表χ2检验、连续性校正或Fisher精确概率法分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Srx在宫颈鳞癌、CIN Ⅲ及正常宫颈组织中的表达 Srx在CIN Ⅲ及宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为73.3%(11/15)、82.7%(86/104)，明显高于正常宫颈组织[35.0%(7/20)]，差异有统计学意义(χ2=17.778，P=0.000，表1、图1A-C)。正常宫颈组织中Srx的阳性表达率与CIN Ⅲ、宫颈鳞癌组织比较差异均有统计学意义(χ2=5.042，P=0.023；χ2=20.349，P=0.000)，而CIN Ⅲ与宫颈鳞癌组织比较差异无统计学意义(χ2=0.267，P>0.05)。另外，癌旁正常宫颈上皮组织和癌组织中Srx阳性表达率分别为59.6%及82.7%，在癌旁正常组织中细胞染色以浅黄色为主，－占21.1%(22/104)，而在癌组织中－占70.2%(73/104)，两者间比较差异有统计学意义(P<0.05)。Srx在肿瘤组织和宫颈上皮细胞中可有阳性表达，间质几乎不表达。在宫颈组织中Srx蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒，主要位于细胞质中，但也有部分组织在细胞膜表达(图1D-F)。在Srx的阳性表达标本中，癌组织中Srx为胞质阳性表达的例数占总阳性例数的94.2%(81/86)，而胞膜阳性表达占5.8%(5/86)；癌旁组织中胞质阳性表达占90.3%(56/62)，而胞膜阳性表达占9.7%(6/62)。统计学分析显示，癌组织及癌旁组织中Srx的表达部位(胞质或胞膜)差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表1 Srx在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌组织中的表达差异Tab.1 Expression of Srx in normal cervical tissues, CIN Ⅲand cervical squamous cell carcinoma tissues

图1 Srx在宫颈组织中的表达情况(SABC)Fig.1 Expression of Srx in cervical tissues (SABC)A, B and C. The positive expression of Srx in normal cervical tissues, CIN Ⅲ tissues and cervical squamous cell carcinoma tissues, respectively; D. Srx located in cytoplasm in cervical squamous cell; E and F. Srx located in cell membrane of both cervical squamous cell carcinoma tissues and normal cervical tissues

表2 Srx在宫颈癌和癌旁正常宫颈组织中的表达差异Tab.2 Expression of Srx in cancer tissue and adjacent normal tissues

2.2 Srx在宫颈癌中的表达与宫颈癌临床病理参数的关系 宫颈鳞癌组织中Srx的表达与患者年龄、临床分期、肿瘤大小及癌组织分化程度无关(P>0.05)，但Srx在淋巴结转移组和无转移组、有脉管浸润组与无脉管浸润组、浅肌层浸润组和深肌层浸润组的阳性表达率差异均有统计学意义(P<0.05)，提示Srx的过表达与淋巴结转移、脉管浸润及肿瘤的肌层浸润深度有关(P<0.05，表3)。

3 讨 论

宫颈鳞癌是宫颈最常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的健康，且近年来我国宫颈癌的发病呈年轻化和上升趋势。目前，手术根治是治疗宫颈癌有确切疗效的方法之一，但临床上只有少部分患者能够获得根治手术的机会，大多患者在确诊时已经发展至晚期，出现浸润、转移而失去了手术机会。所以，宫颈鳞癌浸润、转移仍是影响患者治疗效果和预后的主要原因。探讨宫颈鳞癌浸润及转移相关的因素，寻找有效、特异的转移相关基因并研究其功能，不仅有利于阐明宫颈鳞癌浸润、转移的分子机制，还能为临床诊疗、药物筛选及预后判断提供新的靶点[9]。

人的Srx相对分子量为13～16kD，基因定位于染色体的20p13，最早在啤酒酵母中被发现。Srx蛋白由一个单基因所编码，从细菌到脊椎动物至今未发现其他亚型[10]。前期对该蛋白功能的研究主要停留于最基本的抗氧化作用[11]。近年来，有学者发现Srx与多种肿瘤关系密切，可能对肿瘤细胞的恶性行为起促进作用[12]，且其在多种肿瘤组织如肺癌、胰腺癌、黑色素瘤及多种类型的皮肤癌均呈高表达[13-16]。但目前国内外尚未见Srx与宫颈癌关系的研究，而最近，本课题组发现Srx基因对宫颈癌HeLa细胞恶性生物学行为具有促进作用，降低Srx的表达可抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移及增殖能力[17]。

表3 Srx表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系Tab.3 The relationship of the expression of Srx protein to the cancer clinical pathological parameters

本研究通过免疫组化方法检测了139例宫颈组织(宫颈鳞癌104例，CIN Ⅲ 15例，正常宫颈20例) 中Srx蛋白的表达情况，宫颈鳞癌和CIN Ⅲ组织中Srx表达明显高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(P<0.05)。为了消除个体间差异，我们也检测了宫颈鳞癌及其癌旁正常宫颈组织中Srx蛋白的表达，结果显示鳞癌组织中Srx蛋白的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。本研究证实，Srx在肿瘤实质细胞和宫颈上皮细胞中均可有阳性表达，但在间质细胞中几乎不表达。Srx在宫颈组织中主要定位于细胞质，但也有少部分只在胞膜表达(不论是癌组织还是正常宫颈组织)。这与肺癌组织中的表达情况有一定差异：有学者发现Srx只表达于肺癌组织的细胞质[18]，而Kim等[13]认为Srx表达于肺癌组织的核仁和胞质中，而且Srx的阳性表达更倾向于发生在肺鳞癌中。这可能是组织间的差异性所致。在宫颈组织中Srx主要表达于胞质，这是否与其致肿瘤的生物学特性有关，还有待更进一步的研究。另外，本研究还发现宫颈鳞癌组织中Srx的过度表达随着肌层浸润的加深有逐渐增高的趋势，并且在淋巴结转移组中的阳性表达率明显高于非转移组(P<0.05)，提示该蛋白可能是宫颈鳞癌淋巴转移的危险因素之一，其高表达可能成为研究宫颈鳞癌淋巴转移新的分子标志。有研究表明Srx与过氧化物氧还蛋白Ⅳ(peroxiredoxin Ⅳ，Prx Ⅳ)可通过特异的磷酸激酶信号促进肺癌的转移[7]。但是Srx在宫颈鳞癌中促进转移的具体机制尚不清楚。

Wei等[10]在体外实验中证实了Srx是一种致癌的关键蛋白，并且可作为人类结直肠癌致病性的标志物。Srx的过表达可能提示患者预后不良[14]。另外，Merikallio等[18]研究发现，经过放化疗的肺癌患者组织中若检测到Srx蛋白过表达则预示着预后不良。

本研究结果表明，Srx在宫颈鳞癌中呈高表达，提示其可能通过相关途径参与了宫颈鳞癌的恶性进展。因此，进一步研究Srx是如何影响肿瘤的恶性行为具有重要意义。另外，我们下一步的工作，除了进一步研究Srx影响肿瘤恶性行为的分子机制外，还将探讨Srx表达水平对宫颈鳞癌放化疗患者的预后是否具有预测作用。总之，检测Srx可能有助于综合判断宫颈鳞癌的恶性程度和浸润转移潜能，Srx可能成为宫颈鳞癌早期诊断及预后评估的一个有价值的指标。

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Expression and clinical significance of sulfiredoxin expression in cervical squamous cell carcinoma tissue

CHEN Xiao-yan1, LIU Qin1, LAN Kang-yun1, WANG Shan1, LIU Bin2, WANG Hui1*1Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
2Clinical Pathology Diagnosis Center, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: 15310918845@163.com

, E-mail: 15310918845@163.com

ObjectiveTo inquire into the expression and its clinical significance of sulfiredoxin (Srx) in cervical squamous cell carcinoma tissue.MethodsSABC immunohistochemical method was used to detect the expression levels of Srx in specimens of 104 cervical squamous cell carcinoma and the corresponding adjacent tissues, 15 cervical intraepithelial neoplasm (CIN Ⅲ), and 20 normal cervical squamous cell epithelium tissue. The relationship between the expression of Srx protein and clinical pathological parameters of the cancer was also analyzed.ResultsThe positive expression rates of Srx in CIN Ⅲ and cervical squamous cell carcinoma [73.3%(11/15) and 82.7%(86/104), respectively] were significantly higher than that in normal cervical tissue [35.0%(7/20),χ2=17.778,P=0.000]. Meanwhile, Srx expression in cervical cancer specimens was significantly higher than that in normal adjacent tissues (χ2=56.224,P=0.000). The positive expression of Srx in cervical squamous cell carcinoma was significantly correlated with lymph node metastasis, the depth of cancer invasion, and the infiltration of blood vessels (P<0.05), but it was not related with age, clinical stage (FIGO), volume of primarily tumor, or degree of differentiation (P>0.05).ConclusionThe higher expression of Srx protein might be a valuable marker for the early diagnosis and evaluation of prognosis in patients with cervical squamous cell carcinoma.

sulfiredoxin; uterine cervical neoplasms; immunohistochemistry

R711.74

A

0577-7402(2015)08-0656-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.11

2015-03-31；

2015-05-25)

(责任编辑：张小利)

陈小燕，硕士研究生。主要从事妇科肿瘤方面的基础与临床研究

400016 重庆 重庆医科大学附属第一医院妇产科(陈小燕、刘琴、兰康云、王珊、王辉)；400016 重庆 重庆医科大学病理诊断中心(刘斌)

王辉，E-mail：15310918845@163.com