葛根素联合依达拉奉对烟雾所致吸入性肺损伤大鼠的治疗作用

2015-06-28王正冠李芮冰徐舒敏郭宇妮陈文燕陈宜鸿王成彬

解放军医学杂志 2015年1期

王正冠，李芮冰，徐舒敏，郭宇妮，陈文燕，陈宜鸿，王成彬

·军事医学·

王正冠，李芮冰，徐舒敏，郭宇妮，陈文燕，陈宜鸿，王成彬

目的探讨葛根素联合依达拉奉对黑火药烟雾所致吸入性肺损伤大鼠的治疗作用。方法健康雄性Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组(N组)、吸入性肺损伤组(X组)、葛根素组(P组)、依达拉奉组(E组)、联合用药组(L组)，每组8只。除正常对照组外，其余各组大鼠使用自制发烟装置构建吸入性肺损伤模型，依达拉奉组造模成功后30min腹腔注射依达拉奉(9mg/kg) 1次，第2天给药1次，共2次；葛根素组造模成功后30min注射葛根素(100mg/kg) 1次，每天给药1次，共6次；联合用药组造模成功后30min注射依达拉奉(9mg/kg) 1次，第2天给药1次，共2次，注射葛根素(100mg/kg) 1次，每天给药1次，共6次；正常对照组和吸入性肺损伤组腹腔注射生理盐水(12ml/kg)，每天1次，共6次。建模后第6天大鼠腹主动脉取血，检测动脉血气指标，并采用ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10的水平；留取肺组织制备肺组织匀浆，测定其蛋白含量及髓过氧化物酶(MPO)活性；取部分右肺组织，HE染色后观察肺组织病理学变化。结果血气分析结果显示，P﹑E﹑L组大鼠PaO2均明显高于X组(P<0.05)，且E、L组明显高于P组(P<0.05)，而L组PaCO2水平明显低于X组及E组(P<0.05)。P﹑E﹑L组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平及肺组织匀浆蛋白含量、MPO活性均明显低于X组(P<0.05)，且E﹑L组血清TNF-α、IL-6水平及肺组织匀浆蛋白含量、MPO活性明显低于P组，血清IL-10水平明显高于P组(P<0.05)，L组血清TNF-α、IL-6水平及肺组织匀浆蛋白含量明显低于E组(P<0.05)。光镜观察显示，与X组比较，P﹑E、L组肺组织水肿减轻，炎性细胞浸润减少，且L组更显著。结论依达拉奉联合葛根素可能通过减少部分炎症介质的产生和释放，减轻烟雾吸入性肺损伤大鼠体内的炎症反应，对肺组织起到一定的保护作用，且联合用药比单独用药的效果更好。

依达拉奉；葛根素；肺炎，吸入性

吸入性损伤是热力或烟雾引起的呼吸道以及肺实质损害[1]，可导致严重的全身性病变，病死率较高，其中重度吸入性损伤的病死率高达80%以上。黑火药被广泛应用于军事和民用方面，如战争演习或烟花爆竹的燃放等，在其爆炸、燃烧过程中释放的有毒气体及粉尘颗粒会引发急性吸入性肺损伤，造成肺组织充血、水肿及炎性细胞浸润等。

依达拉奉(edaravone，ED)是一种新型的强效氧自由基清除剂，可抑制脂质过氧化反应，从而抑制组织细胞的氧化损伤，在临床上已被广泛用于脑血管疾病的治疗[2]。葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提纯分离得到的异黄酮，临床应用于治疗高血压、冠心病心绞痛和糖尿病等[3]。依达拉奉与葛根素联合应用能否减轻吸入烟雾所致的肺损伤目前尚未见相关报道。本研究通过建立黑火药烟雾所致肺损伤大鼠模型，探讨依达拉奉联合葛根素对烟雾吸入性肺损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器依达拉奉(规格：5ml/10mg，南京先声东元制药有限公司，批准文号：国药准字H20031342)，葛根素(规格：2ml，成都天台山制药有限公司，批准文号：国药准字H20057087)，硝酸钾、碳粉、硫黄粉(纯度99.9%，200目，北京西四化工原料公司)，大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10 ELISA试剂盒(美国R&D公司)，大鼠髓过氧化物酶(MPO)试剂盒(南京建成公司)，微量加样器(Eppendorf)，光学显微镜(Olympus)，酶标仪(美国AWARENESS)。

1.2 动物分组及处理健康雄性Wistar大鼠40只，体重210～230g，由解放军总医院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(京)2012-0001。大鼠于实验动物中心清洁房中饲养，温度21～24℃，湿度50%～60%，昼夜12h节律，自由进食、饮水。将40只大鼠随机分为正常对照组(N组)、吸入性肺损伤组(X组)、葛根素组(P组)、依达拉奉组(E组)、联合用药组(L组)，每组8只。空白对照组大鼠暴露于动物烟熏箱的空气中8min，葛根素组、依达拉奉组、联合用药组、烟熏组置于动物烟熏箱中并在10g火药产生的烟雾中暴露8min，制作黑火药烟雾吸入性肺损伤大鼠模型。依达拉奉组造模成功后30min腹腔注射依达拉奉(9mg/kg) 1次，第2天给药1次，共2次；葛根素组造模成功后30min注射葛根素(100mg/kg) 1次，每天给药1次，共6次；联合用药组造模成功后30min注射依达拉奉(9mg/kg) 1次，第2天给药1次，共2次，注射葛根素(100mg/kg) 1次，每天给药1次，共6次；正常对照组和吸入性肺损伤组腹腔注射生理盐水(12ml/kg)，每天1次，共6次。所有大鼠均于暴露后第6天处死。

1.3 标本采集及指标检测按照1ml/kg剂量腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠，暴露分离腹主动脉后取动脉血1ml，并于30min内进行动脉血气分析。取大鼠腹主动脉血，3000r/min离心15min后取上清液，采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-10的水平，具体操作参照试剂盒说明书进行。

打开胸腔后观察肺组织大体病理改变，取右肺后叶浸入4%中性甲醛溶液中固定24h，石蜡包埋，4μm连续切片，常规HE染色后光镜下观察病理组织学改变。取左肺组织及时保存于－80℃冰箱中待测，检测时以滤纸吸干肺组织表面污物，制备肺组织匀浆，用考马斯亮蓝法测定匀浆液中蛋白含量，参照试剂盒说明书测定MPO活性。

1.4 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计分析。符合正态分布及方差齐的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉血气分析结果与N组比较，其余各组建模后第6天动脉血气指标PaO2明显降低，PaCO2明显升高(P<0.05)。与X组比较，P组﹑E组﹑L组大鼠PaO2均明显升高，且E组﹑L组PaO2高于P组(P<0.05)。L组大鼠PaCO2水平明显低于X组及E组(P<0.05)，而X组、P组﹑E组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 各组大鼠动脉血气指标PaO2、PaCO2比较(mmHg，±s，n=8)Tab. 1 Comparison of arterial blood gas indexes (PaO2and PaCO2) in rats of five groups (mmHg,±s,n=8)

(1)P<0.05 compared with N group; (2)P<0.05 compared with X group; (3)P<0.05 compared with P group; (4)P<0.05 compared with E group

47.97±5.98(1) 60.20±4.36(1)P 60.73±8.26(1)(2) 54.78±7.54(1)E 71.02±9.57(1)(2)(3) 57.92±8.22(1)L Group PaO2 PaCO2N 89.11±4.26 40.77±4.66 X 77.71±12.91(1)(2)(3) 49.18±7.13(1)(2)(4)Fvalue 26.107 11.205Pvalue <0.05 <0.05

2.2 血清TNF-α、IL-6 、IL-10水平比较与N组比较，除P组IL-10水平无明显改变外，其余各组建模后第6天血清TNF-α、IL-6、IL-10水平均明显升高(P<0.05)。P组﹑E组﹑L组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平均明显低于X组(P<0.05)，且E组﹑L组TNF-α、IL-6水平明显低于P组，IL-10水平明显高于P组(P<0.05)，L组血清TNF-α、IL-6水平明显低于E组(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-10水平比较(pg/ml,±s,n=8)Tab. 2 Comparison of serum TNF-α, IL-6 and IL-10 levels in rats of five groups (pg/ml,±s,n=8)

(1)P<0.05 compared with N group; (2)P<0.05 compared with X group; (3)P<0.05 compared with P group; (4)P<0.05 compared with E group

Group TNF-α IL-6 IL-10 N 16.44±1.23 25.10±1.58 60.72±1.04 X 81.83±8.19(1) 78.12±6.00(1) 90.89±6.55(1)P 64.96±9.92(1)(2) 51.68±9.59(1)(2) 61.15±5.25(2)E 53.14±9.12(1)(2)(3) 42.08±4.28(1)(2)(3) 66.41±5.31(1)(2)(3)L 43.35±5.26(1)(2)(3)(4)32.99±4.27(1)(2)(3)(4)68.05±2.62(1)(2)(3)Fvalue 86.241 102.018 57.635Pvalue <0.05 <0.01 <0.05

2.3 肺组织蛋白含量及MPO活性比较与N组比较，其余各组建模后第6天肺组织蛋白含量及MPO活性均明显升高(P<0.05)。P组﹑E组﹑L组大鼠肺组织匀浆蛋白含量、MPO活性均明显低于X组(P<0.05)，且E组﹑L组明显低于P组(P<0.05)，L组肺组织匀浆蛋白含量明显低于E组(P<0.05，表3)。

表3 各组大鼠肺组织匀浆蛋白含量及MPO活性比较(±s，n=8)Tab. 3 Comparison of MPO activity and protein content in lung tissue in rats of five groups (±s,n=8)

(1)P<0.05 compared with N group; (2)P<0.05 compared with X group; (3)P<0.05 compared with P group; (4)P<0.05 compared with E group

1.79±0.32(1)(2) 2.36±0.19(1)(2)E 1.03±0.16(1)(2)(3) 2.04±0.15(1)(2)(3)L 0.56±0.09(1)(2)(3)(4) 1.89±0.20(1)(2)(3)Fvalue 130.764 106.106Pvalue <0.01 <0.05 Group Protein (mg/ml) MPO (U/g) N 0.18±0.01 1.24±0.15 X 2.65±0.39(1) 3.04±0.21(1)P

2.4 肺组织病理学观察结果 HE染色光镜观察显示，N组大鼠肺泡结构清晰完整，肺泡腔中未见白细胞或渗出液，肺泡壁光滑；X组可见明显水肿和出血，肺泡间隔明显不均，肺泡壁明显充血、增厚，大量炎性细胞浸润；P组可见肺泡仍有萎陷和扩张，其大小形态尚不规则，气道周围组织增厚，毛细血管充血扩张。与P组比较，E组﹑L组肺泡间质炎性浸润均明显减轻，肺泡腔内未见渗出，组织水肿及肺泡萎陷程度进一步减轻(图1)。

3 讨论

吸入性损伤是热力或烟雾引起的上呼吸道、气管支气管以及肺实质损伤[4]，烟雾中的化学刺激物为大小不等的颗粒和毒气[5]，会引起渐进性细胞损伤和严重肺损伤，若不能得到及时诊断和治疗，则有可能进展为急性呼吸窘迫综合征，引起脓毒症等全身症状，最终导致多器官功能障碍综合征甚至死亡。军事行动和训练中，常使用各种火药烟雾，如阿富汗和伊拉克战场上，美军常使用各种烟雾发生器，以达到隐蔽己方免受攻击的目的[6]。除军事人员经常接触烟雾外，非战时发生的民用设施火灾所致人员死亡中，约80%是由于吸入燃烧产生的有毒气体而非烧伤导致死亡[7]。

目前用于急性肺损伤治疗的药物主要有血管舒张剂(采用吸入给药，如一氧化氮吸入﹑前列环素吸入等)﹑肾上腺糖皮质激素﹑非甾体类抗炎药物﹑酮康哇等，但总体疗效不甚满意，所以目前尚缺乏安全有效的早期干预和延缓疾病进展的手段。依达拉奉是一种有效的氧自由基清除剂，能有效抑制脂质过氧化反应。在缺血再灌注后静脉给予依达拉奉，能阻止大鼠脑水肿和脑梗死的进展，并改善脑水肿和脑梗死所伴随的神经系统症状，通过抑制脂质过氧化反应减轻神经元、神经胶质细胞和毛细血管内皮细胞的损伤。葛根素是野生植物葛根中异黄酮的主要有效成分之一，可通过清除氧自由基、扩张脑血管、增加脑灌注量来降低局灶性脑缺血再灌注引起的脑损伤。目前研究发现，葛根素对脑缺血的保护作用主要包括以下几个方面：①具有抗氧化、抗自由基作用；②抑制p53基因表达，下调c-fos蛋白、caspase-3蛋白、Bax蛋白和上调bcl-2蛋白表达，抗神经细胞凋亡；③下调TNF-α、IL-1β的表达，抑制局灶性脑缺血再灌注的炎症反应；④改善脑微循环等[8-9]。

图1 各组大鼠肺组织病理学观察结果(HE×100)Fig. 1 Histopathology observation of lung tissues in rats of five groups (HE×100)

本研究使用自制的发烟装置建立了黑火药烟雾所致吸入性肺损伤模型[10]，分别使用葛根素、依达拉奉、葛根素联合依达拉奉进行干预，并观察其治疗效果。动脉血气分析显示大鼠在烟熏处理后即出现低氧血症，PaO2降低，PaCO2升高，L﹑E﹑P组吸入性肺损伤大鼠的PaO2水平均明显升高，L组的PaCO2水平明显降低(P<0.05)。MPO是中性粒细胞与单核细胞的标志酶，其活性高低可反映组织中中性粒细胞的浸润情况[11]。本研究结果显示，L、E、P组肺组织中MPO活性均显著降低(P<0.05)，表明依达拉奉及葛根素均能有效抑制中性粒细胞浸润及MPO的释放，减轻肺组织损伤，从而起到保护作用。TNF-α被认为是引起急性肺损伤最重要的细胞前炎性因子之一，来源于巨噬细胞，是一种多功能促炎因子，可激活NF-κB介导其他细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8)的合成与释放，启动炎症级联反应。TNF-α还能促进中性粒细胞(PMN)的吞噬能力，促进PMN脱颗粒和释放溶酶体，增强PMN呼吸爆发，产生过多的氧自由基[12]，破坏肺血管内皮细胞和肺上皮细胞，加速急性肺损伤的发展进程。本研究结果显示，依达拉奉和葛根素均可降低烟雾吸入致肺损伤大鼠血清的TNF-α水平(P<0.05)，且联合用药比单独用药效果更显著(P<0.05)。IL-6可促进细胞间黏附分子1的表达，并促进淋巴细胞的分化和炎性激活，使炎性损伤反应进一步加强[13]。本研究结果显示，依达拉奉和葛根素均可降低烟雾吸入致肺损伤大鼠血清IL-6水平(P<0.05)，且联合用药比单独用药效果更显著(P<0.05)。IL-10可减轻炎性介质对肺组织的破坏作用，在肺组织中由T淋巴细胞、B淋巴细胞以及单核巨噬细胞合成和分泌，其主要功能是抑制IL-1β、IL-8、TNF-α等前炎性细胞因子的合成和分泌[14]。本研究结果显示，依达拉奉和葛根素均可提高烟雾吸入致肺损伤大鼠血清IL-10水平(P<0.05)，但联合用药效果增加不明显。本研究肺组织病理切片观察也显示出与上述实验结果相同的结论。

综上所述，本研究采用黑火药发烟装置构建大鼠吸入性肺损伤模型，结果显示依达拉奉和葛根素对其具有很好的治疗作用，且二者联合用药比单独用药效果更佳，为依达拉奉和葛根素的临床应用提供了实验依据。

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Effects of puerarin combined with edaravone on inhalation lung injury induced by black gunpowder smog in rats

WANG Zheng-guan1, LI Rui-bing1, XU Shu-min1, GUO Yu-ni1, CHEN Wen-yan1, CHEN Yi-hong2*, WANG Cheng-bin1*1Department of Clinical Laboratory,2Department of Medical Security, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

*Corresponding author. CHEN Yi-hong, E-mail: 9578cyh@sina.com; WANG Cheng-bin, E-mail: wangcb301@126.com

This work was supported by the “Twelfth Five-Year Plan” Medical Science Development Foundation of PLA (CWS12J021)

ObjectiveTo explore the protective effects of puerarin combined with edaravone on inhalation lung injury induced by black gunpowder smog in rats.MethodsForty healthy male Wistar rats were randomly divided into normal control group (group N), inhalation group (group X), puerarin group (group P), edaravone group (group E) and edaravone combined with puerarin group (group L), with 8 rats in each group. Rat model of inhalation lung injury was reproduced by a self-made smoke generator. Rats in group E were given intraperitoneal injections of edaravone (9 mg/kg) at 30 minutes and 1 day after modeling (twice totally). Rats in group P were given intraperitoneal injections of puerarin (100 mg/kg) at 30 minutes and 1, 2, 3, 4, 5 days after modeling (6 times totally). Rats in group L were treated the way of both group E and P. The rats in group N and group X were given intraperitoneal injections of normal saline (12 ml/kg) at the time-points above. The animals were sacrificed 6 days after modeling, and the blood samples were collected from abdominal aorta to assess arterial blood gas values, meanwhile the serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10) were determined by ELISA. Lung tissue homogenates were prepared to determine the protein content and myeloperoxidase (MPO) activity. The pathological changes in the lung tissue with HEstaining were observed under light microscope.ResultsArterial blood gas analysis revealed that the PaO2levels in groups P, E and L were higher than that in group X (P<0.05), and the PaO2levels in groups E and L were higher than that in group P (P<0.05), while the PaCO2level in group L was lower than that in groups X and E (P<0.05). The TNF-α, IL-6 and IL-10 levels in serum, the protein content and MPO activity in lung tissue homogenate in groups P, E and L were lower than those of group X (P<0.05). The TNF-α and IL-6 levels in serum and protein content and MPO activity in lung tissue homogenate in groups E and L were lower than those of group P (P<0.05), while IL-10 level in serum was higher than that of group P (P<0.05). The TNF-α and IL-6 levels in serum and protein content in lung tissue homogenate in group L were lower than those of group E (P<0.05). HE staining revealed that lung edema was alleviated and inflammatory exudate and infiltration in groups P, E and L were less marked when compared with group X, while they were more significant in group L.ConclusionsEdaravone combined with puerarin can alleviate the inflammatory reaction of inhalation lung injury induced by black gunpowder smogviareducing the production and release of pro-inflammatory mediators, thus playing a protective role against lung injury. The effect of a combination of the drugs is better than that of either drug alone.

edaravone; puerarin; pneumonia, aspiration

R563.19

0577-7402(2015)01-0066-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.15

2014-09-12；

2014-12-01)

(责任编辑：胡全兵)

全军“十二五”医学科研基金面上项目(CWS12J021)

王正冠，硕士研究生。主要从事战时烟雾吸入致肺损伤的炎症反应机制及药理防治研究

100853 北京解放军总医院临床检验科(王正冠﹑李芮冰﹑徐舒敏﹑郭宇妮﹑陈文燕﹑王成彬)，医学保障部(陈宜鸿)

]陈宜鸿，E-mail：9578cyh@ sina.com；王成彬，E-mail：wangcb301@126.com