小儿腹泻外敷散对腹泻大鼠小肠Cajal细胞超微结构及血管活性肠肽受体1表达的影响

陈思伟，唐哲，刘莉，邹志鹏，陈育尧，林晓春

小儿腹泻外敷散对腹泻大鼠小肠Cajal细胞超微结构及血管活性肠肽受体1表达的影响

陈思伟，唐哲，刘莉，邹志鹏，陈育尧，林晓春

目的探讨小儿腹泻外敷散对腹泻大鼠小肠Cajal间质细胞(ICC)和血管活性肠肽受体1(VIP-R1)表达的影响。方法30只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、药物组，每组10只。采用番泻叶水煎液灌胃(2ml/100g)的方法建立腹泻模型，药物组给予小儿腹泻外敷散贴敷。采用透射电镜观察药物对腹泻大鼠小肠ICC超微结构的影响，免疫组化法观察VIP-R1在腹泻大鼠小肠内的分布，RT-PCR和Western blotting测定VIP-R1 mRNA和蛋白表达水平。结果药物贴敷可使ICC形态和缝隙连接基本恢复正常。VIP-R1主要分布在小肠组织环形肌与纵形肌之间、小肠组织肌间神经丛处、结肠黏膜层上皮细胞及固有层细胞的周围。小儿腹泻外敷散可抑制VIP-R1分泌并下调VIP-R1 mRNA及蛋白表达。结论小儿腹泻外敷散可修复腹泻大鼠损伤的ICC细胞，同时可通过下调VIP-R1表达而治疗腹泻。

小儿腹泻外敷散；腹泻；Cajal小肠细胞；受体，血管活性肠多肽，Ⅰ型

“小儿腹泻外敷散”收载于《中国药典》，由丁香、肉桂、吴茱萸、胡椒组成，具有温中散寒、止痛止泻之功，外敷脐部，用于小儿脾胃虚寒所致泄泻。现代医学认为，腹泻与胃肠动力紊乱有关，胃肠道Cajal间质细胞(ICC)是胃肠平滑肌的起搏细胞，能产生胃肠道慢波，控制平滑肌收缩节律、蠕动方向和速度[1]。血管活性肠肽(VIP)为重要的神经递质，与胃肠道的血管活性肠肽受体1(VIP-R1)结合后，可激活cAMP依赖性蛋白激酶，对胃肠运动起调节作用。VIP-R1也是目前发现的胃肠道ICC细胞膜上的主要受体之一[2]。本研究观察了小儿腹泻外敷散对番泻叶所致脾虚泄泻大鼠小肠组织ICC细胞的超微结构及VIP-R1表达的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要仪器 SPF级雄性Wistar大鼠30只，3～4周龄，由南方医科大学实验动物中心提供[许可证号scxk(粤)2011-0015]。透射电子显微镜(Hitachi，H-7500，日本)，石蜡切片机(Leica，德国)，蛋白紫外分光光度计(Eppendorf，德国)，iQTM5多重实时荧光定量PCR仪、Mini-PROTEAN垂直电泳和转膜系统(Bio-Rad，美国)。

1.2 主要药品与试剂 小儿腹泻外敷散贴敷剂(自制，吴茱萸9份、胡椒6份，丁香6份、肉桂6份，粉碎成细粉，混匀，临用前取药粉0.4g，以食醋l0ml调和成直径1cm大小的药饼)。VIP-R1抗体(Biorbyt orb100402，100μg)，免疫组化二步法EnvisionTM试剂盒(丹麦DAKO公司)，总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Trizol试剂、第一链cDNA合成试剂盒(广州贝奥吉因生物科技有限公司)，β-actin(美国Santa Cruz)，兔抗羊IgG-HRP、SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (美国Pierce)，RNase-Free DNase Ⅰ(美国Qiagen)，Power SYBR® Master Mix(美国Invitrogen)，甲醇、冰乙酸等常规试剂购于华东医药集团有限公司。

1.3 动物分组 30只大鼠随机分为对照组、模型组、药物组，每组10只。大鼠单笼饲养，笼底垫有滤纸，对照组采用蒸馏水灌胃，其余两组先用20%番泻叶水煎液灌胃，剂量2ml/100g，4d后形成虚泻模型。药物组大鼠从第5天开始敷药，连续5d，1次/d，其中敷药4d后，将大鼠饥饿12h，至第5天最后一次敷药后处死。

1.4 透射电镜观测ICC细胞超微结构 实验大鼠处死后，迅速取距幽门2.5cm的上段小肠，沿系膜缘剖开去除内容物，切成0.1cm×0.1cm大小片段，于2.5%戊二醛中固定。标本固定后切成小块，PBS漂洗，1%锇酸后固定，PBS漂洗，脱水，Spurr树脂渗透包埋，半薄切片，2%甲苯胺蓝染色，定位，超薄切片，载于200目或400目铜栅网上。铀-铅双染色，置于电子透射电镜下观测。

1.5 免疫组化法观察VIP-R1在小肠内的分布4%多聚甲醛缓冲液固定组织标本，石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复，3%H2O2PBS溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗(稀释度为1:100)，37℃下孵育60min。PBS洗3次，滴加山羊抗鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育40min，PBS冲洗3次，DAB显色液显色3min，Harris苏木素液复染1min， 95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以胞质内出现棕黄色物质为阳性反应。

1.6 Real-time PCR法测定VIP-R1 mRNA表达水平小肠组织充分研磨后取80mg提取总DNA，采用分光光度计测定含量和纯度。将提取的总RNA反转录合成cDNA。反应条件：30℃ 10min，42℃ 30min，70℃ 15min。采用Primer Premier 6.0和Beacon Designer 7.8软件进行定量PCR引物设计，由上海生工生物工程有限公司合成。VIP-R1(基因序列号NM_012685.2)：上游5'-GTGCAAGGCAGCGGTGGTTTTCT-3'，下游5'-GAGACGGCCAGCAGGGTGTAT-3'，扩增片段长度99bp。内参18S(基因序列号M11188)：上游5'-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3'，下游5'-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3'，扩增片段长度105bp。采用25μl扩增体系，反应条件：95℃ 1min；95℃ 10s；64℃ 25s(收集荧光)，40个循环。熔点曲线分析55～95℃。各基因相对表达水平以2–ΔΔCt表示。

1.7 Western blotting检测VIP-R1蛋白表达 提取小肠组织总蛋白，行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜。T-TBS(含5%脱脂奶粉)室温封闭1h，T-TBS漂洗，加anti-VIP-R1一抗(1:500)4℃孵育过夜，兔抗羊IgG-HRP二抗(1:5000)，室温1h，上述各步骤间均以T-TBS洗膜。加入发光剂，曝光，显影。采用Bandscan 5.0软件分析条带光密度值(A)，以β-actin为内参计算VIP-R1的相对表达量。

1.8 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 透射电镜观测ICC细胞超微结构 对照组ICC细胞多分布于环形肌与纵行肌之间、环行肌与纵行肌肌束内以及环形肌与肠肌神经丛内。ICC区别于平滑肌细胞，多呈纺锤形或者不规则形，基膜完整，细胞核大，核周胞质较少。细胞质内含有丰富的线粒体、内质网和高尔基体等。ICC细胞之间以及ICC与平滑肌之间通过突起及缝隙相互连接，共同发挥对胃肠道的调节作用。模型组ICC细胞皱缩，突起减少或者明显消失，细胞膜不连续，细胞质形成空泡，出现核周隙，异染色质汇聚于核膜下，细胞器数量减少。ICC与肌纤维细胞之间间隙加大，连接松散。ICC之间以及ICC与肌细胞之间连接缝隙变小或者消失。治疗组ICC细胞形态恢复较好，有少量空泡，突起损伤不明显。部分细胞异染色质有些趋边，明显好于模型组。ICC之间、ICC与肌纤维细胞之间缝隙连接仍然存在(图1)。

2.2 免疫组化法观察VIP-R1在小肠内的分布 VIPR1表达部位主要集中在小肠组织环形肌与纵形肌之间、肌间神经丛处、结肠黏膜层上皮细胞及固有层细胞核的周围(图2)。

2.3 VIP-R1 mRNA及蛋白表达的检测 模型组大鼠小肠组织VIP-R1 mRNA及蛋白表达水平(分别为30.44±2.19，23.92±1.07)与对照组(分别为10.20±0.82，12.89±0.76)比较明显上调，而治疗组VIP-R1 mRNA及蛋白表达水平(分别为16.40±1.31，17.18±1.28)与模型组比较显著下调，差异有统计学意义(P<0.05，图3)，提示番泻叶所致大鼠脾虚腹泻可能与VIP-R1水平增加有关。

图1 药物对腹泻大鼠小肠ICC细胞超微结构的影响Fig.1 Effect of the drug on ultrastructure of ICC in the small intestine of diarrheic rats

图2 药物对腹泻大鼠小肠VIP-R1表达的影响(免疫组化×100)Fig.2 Effect of the drug on the expression of VIP-R1 in the small intestine of diarrheic rats by immunohistochemistry (×100)

图3 药物对腹泻大鼠小肠VIP-R1 mRNA(A)和蛋白(B)表达的影响Fig.3 Effect of the drug on the expression of VIP-R1 mRNA (A) and protein (B) in the small intestine of diarrheic rats

3 讨 论

小儿腹泻外敷散中所含药物均为温里药，用于脾胃虚寒、运化失调所致的寒泻、虚泻。番泻叶作为大肠的缓泻剂，其所致腹泻缓和，粪便稀溏而无异臭，近似寒泻、虚泻。故用此泄泻模型，可以观察到温里方药的温中止泻功效[3]。

近年来的研究表明，胃肠道内的ICC是胃肠平滑肌的起搏细胞，能产生胃肠道慢波，而慢波频率被认为是反映完整肌肉起搏活动的指标。ICC有多个突起，相互连接成网络状，与壁内神经及平滑肌间存在密切联系。目前普遍认为胃肠神经、ICC以及平滑肌细胞间形成的网络状连接是胃肠动力的基本功能单位[4]。ICC数量减少或结构损伤可引发多种胃肠运动疾病[5-7]。本实验中，小儿腹泻外敷散可修复损伤的ICC以及ICC与肌细胞间的连接，使胃肠动力恢复正常。

VIP广泛分布于中枢、外周神经系统和胃肠道肌间、黏膜下神经丛，既可作为神经递质又可作为胃肠激素，影响消化道分泌和胃肠道平滑运动[8]。VIP-R1是VIP受体家族的一种亚型，是G蛋白偶联受体，主要分布于外周组织如肺、小肠、肝、脾等[9-11]，也是目前所知的ICC细胞膜上的主要受体之一。有研究表明，番泻叶所致脾虚寒泻的发病机制与结肠黏膜上皮细胞水通道蛋白(AQPs)的表达发生明显改变有关[12]。针对AQPs表达调控的研究表明，VIP是调控人结肠上皮细胞AQPs表达的主要脑-肠肽物质之一[13]，VIP-R1与VIP具有高亲和力，二者结合后激活G蛋白偶联受体，可能通过cAMP-PKA跨膜信号转导途径影响了AQPs的表达[14]。小儿腹泻外敷散可使VIP-R1表达下调，减轻对AQPs的影响，使结肠内水液转运功能得以恢复，并降低内脏敏感性的异常，从而发挥治疗作用，但其具体机制还有待进一步验证。

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Effect of Xiaoer Fuxie Waifu powder on the ultrastructure of intestinal Cajal cells and expression of neurotransmitter receptor VIP-R1 in rats with diarrhea

CHEN Si-wei1, TANG Zhe2, LIU Li1*, ZOU Zhi-peng1, CHEN Yu-yao1, LIN Xiao-chun11School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
2Department of Pharmacy, 303 Hospital of PLA, Nanning 530021, China

*Corresponding author, E-mail: shyshll@163.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81102823)

ObjectiveTo investigate the effect ofXiaoer Fuxie Waifupowder on intestinal Cajal cells (ICC) and the expression of vasoactive peptide receptor 1 (VIP-R1) in rats with diarrhea.MethodsThirty Wistar rats were divided randomly into three groups: control group, model group, and treatment group (10 each).Folium sennae(2ml/100g) was gavaged to reproduce the diarrheal model.Xiaoer Fuxie Waifupowder was applied topically in the treatment group. Transmission electron microscope was used to observe the changes in ultrastructure of ICC after application of the drug. Immunohistochemistry was used to observe the distribution of VIP-R1 in the intestine of diarrheic rats. RT-PCR and Western blotting were used to determine the expressions of mRNA and protein of VIP-R1.ResultsThe ultrastructure of ICC showed that the drug treatment could normalize the cellular morphology and gap junction. VIP-R1 was found to be distributed mainly between circular muscle and longitudinal muscle, in the myenteric nerve plexus of the small intestine, and was found around the epithelial cells in the mucosal layer of the colon and lamina propria cells.Xiaoer Fuxie Waifupowder inhibited the secretion of VIP-R1 and down-regulated the mRNA and protein expression of VIP-R1. ConclusionXiaoer Fuxie Waifupowder can repair the injured ICC of diarrheic rats and cure diarrhea by down-regulating the expression of VIP-R1.

Xiaoer Fuxie Waifupower; diarrhea; interstitial cells of Cajal; receptors, vasoactive intestinal polypeptide, type Ⅰ

R285.5；R442.2

A

0577-7402(2015)01-0022-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.05

2014-05-13；

2014-07-22)

(责任编辑：李恩江)

国家自然科学基金(81102823)

陈思伟，硕士研究生。主要从事药理学与制剂学方面的研究

510515 广州 南方医科大学中医药学院(陈思伟、刘莉、邹志鹏、陈育尧、林晓春)；530021 南宁 解放军303医院药剂科(唐哲)

]刘莉，E-mail：shyshll@163.com