浏阳黑山羊捻转血矛线虫感染情况调查及pcox1基因分析

周才瑛，王先坤，刘 毅，刘 伟

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）属于毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus），是寄生在羊等反刍动物皱胃和小肠内的一种寄生虫，也叫捻转胃虫［1］。刚采集的虫体为粉红色，形似丝线。在该虫的前部有一圆形口囊，在此口囊内有一圈长矛状的牙齿也被称为背齿，寄居在宿主消化道特别是皱胃时，该背齿可咬住宿主的胃壁，并且长度自由调整，以达到最佳汲血效果［2］寄生在山羊真胃与小肠末端时，主要食物来源为以山羊的血液与黏膜。据报道，2 000条捻转血矛线虫在皱胃黏膜寄生时，每天吸血量可达30mL。虫体吸血时或幼虫在胃肠黏膜内寄生时，常以其虫体的前端刺入黏膜，引起损伤，可使胃肠的完整性受到损害，引发局部炎症，使胃肠的消化、吸收功能降低。捻转血矛线虫的毒素作用也可感染宿主的造血功能，加剧贫血，还能影响胃肠的蠕动，减少消化液的分泌。因失血和血液再生能力的遭到破坏，家畜出现高度贫血，加之胃肠生理机能的扰乱，有的下痢，病畜常表现出营养不良等症状［3］。

浏阳市是黑山羊养殖的主要地区，浏阳黑山羊是经长期选育，是全国少有的纯黑山羊品种，1985年正式定名为浏阳黑山羊并编入《中国山羊》一书。浏阳黑山羊肌纤维细，硬度小，肉质细嫩，味道鲜美，膻味极小，营养价值极高，其含铁量比牛肉高出1倍、比猪肉要高出4倍之多［4］，具有滋阴壮阳、延年益寿和美容之功效，尤其是对年老体弱、多病患者有明显的滋补作用，老幼皆宜。在1982年，湖南省各山羊肉品评中名列前茅。但是捻转血矛线虫是浏阳黑山羊养殖的一大隐患，给养殖户带来直接的经济损失，影响养殖户的收入。对浏阳捻转血矛线虫流行感染情况进行调查分析，通过分子生物学鉴定捻转血矛线虫，可以为浏阳黑山羊养殖提供相关信息，做到及时防治。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体样品 捻转血矛线虫样品采自于浏阳关口镇和浏阳龚家桥市场屠宰的黑山羊于2013年—2014年分别分季度采集，其中，第一季度采自浏阳关口镇，代码HC1、HC2，第二季度采自浏阳关口镇，代码HC3，第三季度采自浏阳龚家桥市场，代码HC4、HC5，第四季度采自浏阳龚家桥市场，代码HC6、HC7。

1.1.2 主要试剂 DNA 抽提试剂盒（Wizard○RSV Genomic DNA Purification System）；DNA Marker DL 2000，Promega公司产品；蛋白酶 K，美国 Merk公司产品；PCR 试 剂（含 Mg2＋、buffer、dNTPs）、vTaqDNA酶，宝生物工程（大连）有限公司产品；溴化乙锭（EB），美国Sigma公司产品；EDTA，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 取样保存 取被宰杀羊的真胃置于相应容器中，用手术刀将真胃打开一小口，先检查切口处，再用剪刀将其胃在容器中剖开，将内容物反复水洗沉淀，发现有虫体并取出来，放入生理盐水清洗一下，放入700mL／L的酒精里保存。

1.2.2 虫体DNA的提取 在700mL／L酒精里取出1条虫子，放入培养皿内清洗6次，每次洗5min，清洗后置于一新EP管中，用高压灭菌过的眼科剪将虫子剪碎，加入裂解缓冲液200μL，混匀；然后加入20μL蛋白酶K（50μg／μL），盖紧盖子于振荡仪上混匀，55℃恒温水浴锅中消化6h～9h，其间数次不定时的手摇动和放于振荡仪上振荡，使虫子与裂解液、蛋白酶K充分接触并裂解。消化好的虫体悬液按Promega公司的基因组DNA抽提试剂盒（Wizard○RSV Genomic DNA Purification System）使用说明书提取虫体DNA，置-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 PCR 扩增 采用 Bowles J等［5］报道的引物：用于扩增线粒体pcox1基因，pcox1保守引物的序列为JB3（上游引物）：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′；JB4.5（下游引物）：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′［4］反 应 体系为：50μL体系，其中双蒸馏水26.5μL；10×PCR buffer 5 μL；MgCl2（25mmol／L）8 μL；dNTPs（25mmol／L）4μL；Primer（50pmol／μL）1μL；Taqpolymerase（5U／μL）0.5μL；模板 DNA 1μL。反应条件：先94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共38个循环；再后72℃5min，最后4℃结束反应。取5μL PCR产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳后，用紫外投射仪观察结果，凝胶成像系统拍照记录，PCR产物放于4℃保存备用。

1.2.4 pcox1序列测定及其在种系发育分析中的应用 将PCR产物送上海生工生物工程技术有限公司测序，用 DNA Star 5.0软件对测序结果研究分析。从GenBank TM检索代表性的捻转血矛线虫pcox1序列，然后与之进行相似性比对和捻转血矛线虫种系发育分析，对获得捻转血矛线虫pcox1序列使用Clustal X2.0及 Mega 4.1软件进行比对及获取遗传信息。系统发育树使用Mega 4.1程序绘制。

2 结果

2.1 感染情况调查

从所检查的结果可以看出浏阳黑山羊捻转血矛线虫在不同的季度感染情况不同。具体感染情况见表1。

2.2 PCR扩增结果

试验7个样品用上述引物均成功地扩增出约480bp的pcox1基因，与所需目的片段长度相符，且无非特异性条带，空白对照为阴性（图1）。

表1 浏阳黑山羊捻转血矛线虫各季度感染率Table 1 Seasonal infection rates of Haemonchus contortus in Liuyang black goats

图1 捻转血矛线虫pcox1基因PCR产物电泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of Haemonchus contortus pcox1gene products by PCR

2.3 基于pcox1基因构建种系发育树

利用Clustal X2.0及 Mega 4.1软件对7株捻转血矛线虫与GenBank中捻转血矛线虫pcox1基因（AB682706.1）进行种系发育分析，以猪蛔虫（KF719142.1）作为外群，采用NJ建树法构建种系发育树。种系发育树显示，7株（HC1～KI7）均与AB682706.1位于较近的分支上，其所属的分支与外群相隔较远，能够很好地得以鉴别。种系发育树中的Bootstrap值较高（图2）。

图2 基于捻转血矛线虫pcox1基因序列构建的进化树Fig.2 Phylogenetic tree of Haemonchus contortus based on pcox1gene sequences

3 讨论

Jacquiet P等［6］采用粪检法对雨季非洲西部多个国家的绵羊和山羊感染捻转血矛线虫情况进行调查，发现感染率达80%～85%；Ningiga A 等［7］通过对PAPUAL地区实地考察羊感染捻转血矛线虫情况，发现该地区绵羊感染捻转血矛线虫后的病死率可达40%；Achi Y l等［8］采用粪便漂浮法对法国Cote d＇Ivoire地区的74头山羊和70头绵羊进行捻转血矛线虫感染率调查，发现95头羊感染有捻转血矛线虫，感染率达66%；Bonfoh B等［9］也采用粪检法对TOGO地区的60头山羊和59头绵羊进行捻转血矛线虫感染情况调查，发现有98头羊受到感染，感染率为82%；Kumar R R等［10］于2001年-2006年5年采集西北印度地区养殖的羊的粪样，并对当地羊感染捻转血矛线虫情况进行调查，本次调查样本中共包括9 261头绵羊和7 262头山羊，其中58.65%的绵羊和55.06%的山羊感染了捻转血矛线虫。

湖南省山羊捻转血矛线虫感染的调查情况如下。王喜军等［11］采用剖检法对湖南省炎陵县龙溪乡某养羊专业户的40余头黑山羊感染捻转血矛线虫病情况进行调查，发现病死率为30%。王晓平等［12］采用剖检法对湘西自治州花垣县、保靖县屠宰场所屠宰山羊的捻转血矛线虫感染情况进行调查后发现，71头山羊中有48头受到感染，感染率为68%。

浏阳市捻转血矛线虫感染调查结果显示，不同季度捻转血矛线虫感染情况不同，春季感染率为39.1%，夏季感染率为46.7%，秋季感染率为81.3%，冬季感染率为53.3%。本研究采用最简单方法的剖检胃，不仅采用了洗涤胃内容物方式进行形态学检查，还采用分子生物学的方法，通过PCR扩增线粒体pcox1基因，鉴定了当地黑山羊感染的捻转血矛线虫虫种，图片显示线粒体基因的大小都为480bp左右。本研究结果为捻转血矛线虫的流行病学调查以及分类鉴定奠定了基础。

［1］汪 明.兽医寄生虫学［M］.3版.北京：科学技术出版社，2003：69.

［2］孙 莉，李 明.羊捻转血矛线虫病［J］.草食动物，2009，5（3）：54.

［3］胡长安.论捻转血矛线虫对山羊的危害及防治［J］.湖南畜牧兽医，2008，15（6）：15-17.

［4］徐松竹，高瞻远.浏阳林山养羊奔小康［J］.湖南畜牧兽医，2011，10（4）：42-43.

［5］Bowles J，Blair D，McManus D P.Geneic variants within the genusEchinococcusidentified by mitochondrial DNA sequence［J］.Mol Biochem Parasitol，1992，54（2）：165-174.

［6］Jacquiet P，Cabaret J，Thiam E，et al.Host rang ang maintenance ofHaemonchusspp in an adverse arid climate［J］.Int J Parasitol，1998，28（3）：253-261.

［7］New ton S E，Muun E A.The development of vaccines against gastrointestinal nematode parasites，partiarlyHaemonchuscontortus［J］.Parasitol Today，1999，15（3）：115-122.

［8］Ningiga A，Nunn M J，OwenI L，et al.Attempts to reduce the impact of helminthiasis in small holder sheep production in Papual［J］.New Guin Vet Assoc，1991，6（2）：7.

［9］Bonfoh B，ZinsstagJ，AnkersP，et al.Epidemiology of gastrointestinal nematodes in small ruminants in the"région des plateaux"in Togo［J］.Revued Elevage et de Med Vet Pays Tropicaux，1995，48（4）：5.

［10］Kumar R R，Yadav C L，Garg R，et al.Prevalence of gastrointestinal nematodes in sheep and goats in some parts of northwest India［J］.Indian J Anim Sci，2008，78（11）：2.

［11］王喜军.黑山羊捻转血矛线虫病的诊治［J］.湖南畜牧兽医，2008，6（2）：20-21

［12］王晓平.花垣与保靖山羊捻转血矛线虫的感染情况调查研究［J］.现代农业科技，2011，2（5）：54