高效液相色谱法测定复方中兽药栓剂中没食子酸的含量

陈 颖，高媛媛，钟留情，范云鹏，麻武仁，宋晓平

（西北农林科技大学动物医学院中兽医药研究所，陕西杨凌712100）

奶牛子宫内膜炎是导致奶牛不孕症的主要原因，对奶牛养殖业危害严重。据统计我国奶牛子宫内膜炎的发病率高达30%以上［1-2］。目前，抗生素及化学合成类药物在奶牛子宫内膜炎等感染性疾病的治疗中仍占有主导地位，但随着这些药物的广泛使用，病原耐药性、药物残留和环境危害亦愈发严重［3-6］，极大地限制了其临床应用。中药多数来自天然，成分多样，疗效历经长久岁月验证，也已成为人们普遍关注的新兽药研发新途径。本实验室崔恩慧等［7］对郁金散拆方抑菌和抗炎作用研究发现，以诃子和黄连组方，对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠埃希菌等奶牛子宫内膜炎常见致病菌具有显著抑制作用，且具有显著的抗炎作用。本试验在前期研究的基础上，以诃子、黄连为主药进行复方中兽药栓剂的制备，并对其质量控制成分进行高效液相色谱定量检测，旨在为该复方中兽药栓剂的进一步应用提供检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 复方中兽药栓剂（每粒质量重3.1g，诃子-黄连2∶1，生药含量1.41g／g），由西北农林科技大学中兽医药研究所研制；没食子酸对照品（没食子酸含量89.9%，批号110831-201204），中国食品药品检定研究院产品。

1.1.2 主要仪器 Waters 600E高效液相色谱仪，美国Waters公司产品；Waters 2487检测器。

1.1.3 主要试剂 甲醇（色谱级），美国TEDIA公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry ShieldTM RP 18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：甲醇-5g／L磷酸（5∶95）；流速：1.0mL／min；柱温：30℃；检测波长：273nm［8］，进样量：10μL。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取一定量没食子酸对照品5.600mg，置10mL棕色容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，配制成0.503 44mg／mL的溶液作为储备液。

1.2.3 供试品溶液的制备 参照文献［9］中的方法，称取栓剂350mg，加甲醇50mL，回流提取1h，放冷，用甲醇补足量。滤过，取续滤液5mL蒸干，加100mL／L HCl 5mL沸水浴中加热水解4h，迅速冷却并移至25mL容量瓶中加水至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

1.2.4 标准曲线的绘制 分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mL 没食子酸对照品储备液于5mL容量瓶中，加水稀释至刻度作为对照品溶液，浓度分别为0.020 137 6、0.040 275 2、0.060 412 8、0.080 550 4、0.100 688、0.201 376μg／μL。精密吸取各对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，并绘制标准曲线。

1.2.5 精密度试验 取没食子酸对照品溶液（0.060 412 8μg／μL），进样量为10μL，重复进样6次，按照1.2.4中方法进样测定峰面积，并计算其RSD。

1.2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按照1.2.4中方法，分别在0、2、4、6、10、24h等时间点进样测定峰面积，计算其RSD。

1.2.7 重复性试验 取同一批次栓剂6份，按照1.2.3中的方法制备供试品溶液，并进样测定峰面积，计算其RSD。

1.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含有量的同一批栓剂6份，加入一定量的没食子酸对照品混合，按照1.2.3中的方法制备供试品溶液，并进样测定，计算回收率。

1.2.9 样品含量测定 取不同批次栓剂，按照上述方法，测定栓剂中没食子酸平均值。

1.2.10 专属性试验 按照复方中药栓剂的处方比例和工艺，同法制成缺诃子的阴性样品，分别精密吸取没食子酸对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μL，按1.2.1中的色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

2 结果

2.1 没食子酸含量测定的标准曲线

没食子酸含量测定的回归方程为y＝6.9×106x-39 068，r＝1.000 0，进样 量在0.201 376μg～2.01 376μg范围内线性关系良好（图1和表1）。

2.2 精密度试验

没食子酸峰面积RSD为1.10%（表2），说明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

没食子酸峰面积RSD为1.17%（表3），说明供试品溶液在24h内稳定。

2.4 重复性试验

没食子酸含量的RSD为1.30%（表4），说明此方法重复性良好。

2.5 加样回收率试验

没食子酸的平均回收率为100.02%，RSD为1.26%（表5），说明本试验的准确性高。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Calibration curve of gallic acid

表1 没食子酸标准品进样量与峰面积Table 1 The content of gallic acid standard and peak area

表2 没食子酸的精密度试验Table 2 The precision test of gallic acid

表3 没食子酸的稳定性试验Table 3 The stability test of gallic acid

表4 复方中兽药栓剂中没食子酸的重复性试验测定结果Table 4 The results of repeated test of gallic acid in suppository of Chinese veterinary medicine

表5 复方中兽药栓剂中没食子酸的加样回收率测定结果Table 5 The results of recovery rate of gallic acid in suppository of Chinese veterinary medicine

2.6 样品含量测定

复方中兽药栓剂样品中没食子酸测定的平均值为3.80%，RSD为0.37%（表6），说明该测定方法准确、可靠，可用于复方中兽药栓剂中没食子酸含量的测定。

2.7 专属性试验

供试品中没食子酸的分离度好，与相邻峰的分离度大于1.5，理论塔板数按没食子酸峰计算不低于6 000，且阴性样品在没食子酸出峰处无色谱峰，说明复方中兽药栓剂中的其他成分对测定结果无影响（图2）。

表6 复方中兽药栓剂中没食子酸含量的测定结果Table 6 Determination of gallic acid content in suppository of Chinese veterinary medicine

图2 复方中兽药栓剂中没食子酸的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of gallic acid in suppository of Chinese veterinary medicine

3 讨论

诃子为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz或绒毛诃子TerminaliachebulaRetz vartomentellaKurt的干燥成熟果实。其味苦、酸、涩、平，归肺、大肠经，具有涩肠、敛肺的功能［10］，现代药理研究证明，诃子具有显著的抗菌、抗炎和抗病毒作用［7，11-13］。诃子主要含有鞣质、三萜和酚酸类化合物，其中鞣质包括水解鞣质和缩合鞣质。水解鞣质具有酯键和苷键，在酸、碱、酶的作用下可水解产生没食子酸或没食子酸聚合物和糖［14-15］。缩合鞣质是一类由儿茶素或其衍生物以碳-碳键聚合而成的化合物，由于结构中无甙键与酯键，故不能被酸、碱水解［16］。在进行复方中兽药栓剂供试品溶液制备时，曾采用样品中加入500mL／L甲醇，再超声处理的方法［8］，但所测得的没食子酸含量较低，随后采用先在供试品中加甲醇回流提取，再于滤液中加100 mL／L HCl沸水浴加热处理，所测定的没食子酸含量明显提高，这可能与复方中兽药栓剂中的水解鞣质分解为游离没食子酸有关。本试验所建立的复方中兽药栓剂中没食子酸含量的测定方法，简便，重现性好，专属性强，可作为该复方中兽药栓剂中诃子质量控制的有效检测方法。

［1］郝景锋，李国江，王永生，等.吉林地区奶牛子宫内膜炎发病情况调查与分析［J］.中国兽医杂志，2013，49（10）：48-49.

［2］姜 明，郑程远，张璐莹，等.黑龙江省牡丹江垦区奶牛子宫内膜炎调查［J］.黑龙江畜牧兽医，2013（22）：85-87.

［3］赵俊利，李培峰，李志芳，等.内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎葡萄球菌毒力基因检测及耐药性研究［J］.畜牧兽医学报，2014，45（2）：295-304.

［4］黄 璐，朱志谦，欧德渊，等.贵阳某奶牛场奶牛子宫内膜炎主要致病菌的药敏试验［J］.动物医学进展，2013，34（5）：122-124.

［5］宁海容，彭 瑛，金兴良，等.牛奶中抗生素残留检测研究进展［J］.中国畜牧兽医，2012（8）：227-230.

［6］余致山，张爱荣，郭春燕，等.某牛场奶牛子宫内膜炎与环境中主要致病菌的分离鉴定、药敏试验及相关性研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2012（3）：113-115.

［7］崔恩慧，智晓艳，范云鹏，等.郁金散拆方的抑菌与抗炎作用［J］.西北农业学报，2015，24（1）：43-48.

［8］李玲莉，王兰霞，倪 琳，等.达斯玛保丸质量标准研究［J］.中国中医药信息杂志，2011，18（10）：62-64.

［9］李先瑞，顾雪竹，肖碧英，等.绒毛诃子与诃子质量评价与比较［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（17）：48-52.

［10］国家兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：二部［S］.北京：化学工业出版社，2010.

［11］蔡小华，谢 兵，杜海军.诃子化学成分及药理作用的研究进展［J］.药学进展，2012，32（5）：212-215.

［12］刘 芳，秦红飞，刘松青.诃子化学成分与药理活性研究进展［J］.中国药房，2012，23（7）：670-672.

［13］罗光伟，陈建江.诃子的药理作用研究进展［J］.云南中医中药杂志，2012，33（11）：78-80.

［14］徐 勤.鞣质的研究进展［J］.华夏医学，2004，17（1）：113-115.

［15］朱 玥，金哲雄.鞣质类化合物的研究进展［J］.黑龙江医药，2015，28（1）：23-25.

［16］邢晶晶，曹婷婷，杨 帆，等.鞣质类化合物研究的进展情况［J］.黑龙江医药，2011，24（5）：776-780.