蓝莓种质资源遗传多样性的SRAP分析

李红侠,陈红玲,王 林,许 磊

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

蓝莓种质资源遗传多样性的SRAP分析

李红侠,陈红玲,王 林,许 磊

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

利用SRAP标记，对来源不同的14份蓝莓种质的亲缘关系进行了分析。从81对SRAP引物中筛选出5对多态性强、重复性好的SRAP引物,共扩增得到96条清晰稳定的条带，其中多态性条带有71条，多态性比率为73.96%。14份蓝莓材料间的遗传相似系数的变化范围为0.47～1.00。在相似系数为0.55的水平上，可将14份蓝莓分成3类，第一类有3份种质，第二类有2份种质，第三类共9份种质。Powderblue和Baldwin-T-117的亲缘关系最近，Duke和Gulfcoast亲缘关系最远，聚类分析的结果与形态分类的结果大致吻合。

蓝莓；种质；遗传多样性；聚类分析

蓝莓(Blueberry),又名越桔，为杜鹃花科(Eyicaceae)越桔属(Vacciniumspp.),多年生落叶或常绿果树，呈灌木，原产于北美[1]。全世界有450种，我国已知91种，主要分布于西南、华南和东北地区[2]。商业性栽培的蓝莓有三大类，即矮灌蓝莓、兔眼蓝莓和高灌蓝莓[3]。蓝莓果除具有较高的营养价值外，还富含花青苷，具有低糖、低脂肪、抗氧化能力强等特点，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。另外，蓝莓果实有抗心血管疾病、防止脑神经老化和抗癌等作用[4-5]。

我国虽是野生蓝莓的主要产地，但栽培品种均引自国外，具有自己知识产权的栽培品种尚未培育出来。由于引种途径多样，品种的资料不尽相同，很难分类鉴定，造成品种的种系不清，直接影响我国在蓝莓育种、品种种植选择以及苗木商品生产等方面的进展。种质资源是优良品种选育的物质基础，进行蓝莓种质资源的搜集是蓝莓生产的重要环节。

相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism,SRAP)是通过独特的引物设计，在优先扩增基因的同时，对内含子、启动子和间隔序列也进行扩增，且可靠性好，重复性高。SRAP标记已在许多植物的遗传图谱构建、基因定位克隆、品种鉴定以及遗传多样性检测等研究方面广泛应用[6-10]。至今，鲜见利用该标记研究蓝莓资源的报道，国内外对蓝莓的研究大多是营养、保健及栽培、种植方面。为此，本研究以蓝莓资源为材料，将SRAP标记用于蓝莓资源的遗传多样性分析，旨在为我国蓝莓新品种的选育提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料共14份，由安徽盛林蓝莓有限公司和沈阳农大提供，编号及名称见表1。

1.2 DNA提取

取蓝莓组培苗幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取DNA[11]，用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测总DNA质量和完整性。用核酸蛋白仪检测，其DNAOD260/OD280值在1.80～2.10之间，适宜进行PCR扩增，-20℃保存备用[12]。

引物筛选：所用引物均来自上海英潍捷基生物技术有限公司，见表2。

标记按上游引物、下游引物两两交叉组合来标记，如Me3/Em1 表示上游引物Me3和下游引物Em1的组合，用7号DNA样品为模板，从81对引物组合中筛选出5对条带清晰、条带数目多、信号强的引物组合(表3)，用于蓝莓遗传图谱的进一步分析。

1.3 PCR扩增

反应体系参照文献[13]，稍作改变。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，36℃复性1 min，72℃延伸1 min，共5个循环；94℃变性1 min，54℃复性1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后在72℃条件下延伸10 min[14]，待结束后保存在4℃条件下。扩增产物在垂直板中电泳，电压100 V,电流80 mA，时间8 h,银染色，紫外灯下观察拍照。

表1 供试的14份蓝莓材料

表2 供试SRAP引物序列

表3 SRAP引物组合在14份蓝莓种质中扩增出的多态性

1.4 数据处理

统计5对产生多态性点的引物在14个DNA样品中扩增的电泳总带数与多态带的数目(表3)。在电泳图谱中，同一SRAP位点上有电泳带记录为1，无电泳带记录为0，作0.1矩阵图输入计算机。采用NTSYS2.10e软件处理，并采用非加权平均法进行聚类分析，得到遗传相似系数，构建聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 蓝莓种质SRAP扩增产物的多态性分析

5对引物组合见表3，其中部分引物组合的扩增结果见图1，共产生96条清晰的条带，平均每个引物组合产生19.2条，71条带表现多态性。每个引物组合产生9～19个多态性带，多态性比率为73.96%,平均每对引物组合产生14.2个多态性的带。其中多态性条带最多的引物组合是Me9/Em9，多态性条带为19，多态性百分率为86.36%；多态性条带最少的引物组合是Me7/Em1，得到多态性条带为9，多态性百分率为50.00%。

图1 部分引物组合的扩增图(左右引物组合Me4/Em2；Me9/Em9)

2.2 建立在SRAP标记的聚类分析

以71个SRAP标记为基础，利用NTSYS-PC(version2.1)计算14份蓝莓种质之间的SM相似系数，其变化范围在0.47～1.00之间(图2)。在遗传距离为0.55时，可将14份材料分为三大类群，第一大类包括品种1、2和4，都是北高蓝莓；第二类包括品种3和9，分别是南高和矮丛蓝莓；第三类包括9个蓝莓品种，在遗传距离0.70处分为两个亚族；Ⅲ-1亚族包括5、11和8，是南高和半高丛品种，其中5和11聚为一类，表明它们的亲缘关系较近，第ⅢI-2亚族中的6个品种，品种10和12聚在一起，都属半高丛蓝莓，品种7和14的遗传相似系数最高，亲缘关系最近，均为兔眼蓝莓。从聚类分析的结果可以看出，北高、南高和半高丛各自聚为一类，说明它们之间的亲缘关系较远，可以利用品种间的杂种优势，北高和南高作为亲本，选育出理想的适应范围广的蓝莓新品种。以上聚类的结果与形态学鉴定结果基本一致。

3 讨论

SRAP标记技术操作方便，结果稳定。在生态型变异和生态型进化史上比AFLP更具有一致性[15],在用形态学特征、系谱关系及分子标记等方法研究作物的遗传多样性时被广泛应用[16]。本试验蓝莓种质之间的遗传相似系数为0.47～1.00，说明蓝莓种质之间遗传多样性较丰富，北高蓝莓、半高丛蓝莓之间的亲缘关系较近，说明它们之间的遗传背景相对较窄，南高、北高以及兔眼蓝莓之间的亲缘关系较远，遗传背景相对较宽，因此，可利用它们之间的亲缘关系相互杂交培育优良品种。

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(责任编辑：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.01.024

2014-08-19

宿州学院科研平台开放项目“蓝莓花色素苷的提取及抗癌活性的研究”(2014YKF31)；宿州学院科研平台开放项目“辣椒土传病害防控技术研究”(2013YKF13)。

李红侠(1971-)，女，安徽萧县人，硕士，高级实验师，主要研究方向：园艺植物组织培养及分子生物学。

S662.4

A

1673-2006(2015)01-0085-03