垂体肿瘤转化基因和血管内皮细胞因子在子宫内膜异位症中的表达及意义

樊红，邵雪斋，张玉娟

(承德医学院附属医院妇产科，河北承德 067000）

垂体肿瘤转化基因和血管内皮细胞因子在子宫内膜异位症中的表达及意义

樊红，邵雪斋，张玉娟*

(承德医学院附属医院妇产科，河北承德 067000）

目的：检测PTTG及VEGF在子宫内膜异位症中异位内膜、在位内膜及对照组正常内膜的表达，并探讨其相关性。方法：选取52例子宫内膜异位症患者的异位内膜、44例在位内膜，27例正常子宫内膜组织为对照组。用逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR）及免疫组化(SP）方法测PTTG、VEGF在三组中的表达情况。结果：PTTG mRNA在子宫内膜异位症中异位内膜组表达高于在位内膜组，在位内膜组表达高于正常子宫内膜组织(P＜0.01，P＜0.01）。PTTG蛋白表达在异位内膜组、在位内膜组、正常内膜组的阳性率分别为：90%、79%、22%，异位内膜组和在位内膜组表达均高于正常子宫内膜组织(P＜0.01，P＜0.01）。VEGF蛋白表达在异位内膜组、在位内膜组、正常内膜组的阳性率分别为： 90%、84%、59%，异位内膜组和在位内膜组表达高于正常子宫内膜组织(P＜0.01，P＜0.01）。等级相关分析PTTG表达与VEGF表达呈正相关关系。结论：子宫内膜异位症中异位内膜组、在位内膜组均有PTTG mRNA及PTTG蛋白表达;且异位内膜组表达均显著高于在位内膜组及正常组;异位内膜组和在位内膜组中VEGF表达高于正常子宫内膜组织;PTTG高度表达可上调VEGF高表达，PTTG与VEGF呈正相关表达，提示子宫内膜活性增强、侵袭力增高，可促进血管形成。

子宫内膜异位症EMs;垂体肿瘤转化基因PTTG;血管内皮生成因子VEGF;逆转录聚合酶链式反应RT－PCR;免疫组织化学SP

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT）指有生长活力的子宫内膜组织(腺体或间质）出现在子宫以外部位，常侵犯器官为卵巢，形成卵巢子宫内膜异位囊肿，虽为良性疾病，但病理上具有类似恶性肿瘤行为，与新生血管形成有密切关系。近些年其发病率及复发率明显上升［1］。几十年以来，通过实验技术的提高和新的研究，内异症倾向于是一种子宫内膜疾病、干细胞疾病和类肿瘤疾病［2，3］。垂体肿瘤转化基因(Pituitary Tumor Transforming gene，PTTG）又称封闭素，是强有力的原癌基因，可参与细胞周期增殖、转化重建细胞外基质等作用，和肿瘤的血管形成及侵袭性有密切关系。血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可直接或间接的作用与血管内皮细胞，导致血管新生。本研究探讨以上指标在子宫内膜异位症中形成血管机制，及它们之间的相关性，可用于指导临床治疗。

1 资料与方法

1.1 临床资料：选取2013年9月至2014年6月在承德医学院附属医院妇科患有EMs住院手术的患者。其中52例为EMs患者的异位内膜，依据美国生育协会(r－AFS）分期标准，其中Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ36例;44例在位内膜，其中增殖期内膜25例，分泌期内膜19例;27例非内异症患者的正常子宫内膜，其中增生期21例，分泌期6例。年龄在22～43岁，平均年龄为32岁，两组患者月经规律(28～32d），术前6个月无激素治疗、无哺乳史，无内外科疾病。正常子宫内膜选取同期患有子宫肌瘤、功血等行子宫全切术患者。所有标本经过我院病理科检查确诊。标本为手术离体后立刻获取，一份经10%甲醛固定、石蜡包埋、连续切片为4um厚度，用于免疫组化染色。另一份取100mg快速放入液氮中准备提取RNA用。

1.2 实验试剂：Trizol试剂购自Inuitrogen公司，PTTG AMV第一链cDNA合成试剂盒，2×Tap PCR Master Mix试剂购自上海生工生物工程。PTTG、VEGF兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物。

1.2.1 PTTG mRNA表达：采用RT－PCR法，用Trizol一步法提取总RNA，用AMV逆转录酶将其反转录成cDNA，扩增片段为145bp，β－actin作为内参照基因为564bp与Genebank所载相符。PTTG基因上游引物(5‵→3‵）：TAG TCC TTG ACG AGG GAG;下游引物(5‵→3‵）：GGTGGC AAT TCA ACA TCC AGG;βactin内参上游引物(5‵→3‵）CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA;下游引物(5‵→3‵）：AAG GAA GAA GGC TGG AAG AGT GC。取PCR产物10ul用经EB染色后的1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外荧光数字成像仪下照像并进行光密度定量分析。以每例PTTG与相应β－actin扩增产物条带累及光密度(IOD）的比值作为PTTGmRNA的相对表达量。

1.2.2 免疫组化：PTTG、VEGF蛋白表达：采用免疫组化Maxvision法，严格按试剂盒说明书操作，结果判定： PTTG及VEGF主要表达于细胞质或细胞核(大多数在细胞质）以其出现棕黄色颗粒为阳性反应。于染色均匀的肿瘤区选取个高倍镜(×400）视野，采用Volm双评分法判定结果：①阳性结果百分率(A值）评分：＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%为3分;②染色强度(B值）评分：不着色为0分，浅棕色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。A+B为0分判断为阴性(－），1～2分为+(弱阳性），3～4分为++(中度阳性），5～6分为+++(强阳性）。

1.2.3 相关性分析：分析上述指标在内异症中异位内膜组和在位内膜组及正常内膜组的表达，各指标与内膜变化和手术分期表达的相关性。

1.3 统计学方法：运用SPSS统计17.0软件包进行分析，计量资料采用单因素方差分析，等级资料采用非参数Kruska1－Wallis检验，相关分析用Spearman秩相关。

2 结果

2.1 PTTGmRNA表达：EMs中异位内膜组织中PTTG mRNA表达量明显高于在位内膜组织和正常子宫内膜组织，其相对表达量分别为：1.02±0.99、0.77±0.10、0.59±0.12(P＜0.01，P＜0.01）。在位内膜组织增生期高于分泌期PTTGmRNA相对表达量(P＜0.01）;正常内膜组织中增生期和分泌期相对表达量差异无统计学意义。三组间PTTG mRNA比较有意义(见表1，见图1）。

2.2 PTTG蛋白表达：PTTG蛋白主要表达于腺上皮细胞胞浆，间质细胞未见明显表达。EMs中异位内膜、在位内膜、正常子宫内膜PTTG蛋白表达阳性率有逐渐升高趋势，分别为90%、79%、22%。三组间比较差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.01），其中异位内膜组和在位内膜组表达强度高于正常内膜组(P＜0.01，P＜0.01），正常内膜组及在位内膜组中，PTTG在增殖期与分泌期的阳性表达率无统计学差异(P＞0.05）。

2.3 VEGF蛋白表达：VEGF蛋白在三组中主要表达于内膜的腺上皮细胞、间质细胞和血管内皮细胞的胞浆和胞膜上，腺上皮细胞表达强于间质细胞，EMs中异位内膜组织、在位内膜组织、正常子宫内膜VEGF的蛋白表达阳性率分别为：90%、84%、59%，(P＜0.01，P＜0.01），三组间比较差异有统计学意义(P＜0.01）其中异位内膜组和在位内膜组表达强度高于正常内膜组(P＜0.01），有统计学意义;正常内膜组及在位内膜组中VEGF中分泌期内膜高于增殖期内膜(P＜0.01）。

2.4 各项指标表达的相关性：PTTG与VEGF表达呈正相关，(r值为0.73，P＜0.001），随着PTTG阳性表达增强，VEGF表达也显著增强。

表1 PTTG mRNA在三组间的表达

表2 PTTG蛋白在三组间的表达

表3 VEGF蛋白在三组间的表达

图1 PTTGmRNA在三组中的表达：1～2正常内膜组织，3～4在位内膜组织，5～6异位内膜组织

图2 PTTG在子宫内膜异位症中异位内膜组的表达(SP染色×200）

图3 VEGF在子宫内膜异位症中异位内膜组的表达(SP染色×200）

3 讨论

大量的研究证实，EMs需要依赖于血管生成［4］，VEGF又称血管通透因子，是新发现的一种多肽类生长因子，来源于腹腔里面活化了的巨噬细胞，是众多血管内皮因子中作用最强的一个因子［5］。VEGF家族有5个成员，分别为VEGF－A、B、C、D和胎盘生长因子(PLGF），其受体有Fit－1和fik－1/KDR，属于酪氨酸激酶受体家族第三亚型。VEGF主要的生物功能是：①直接促进血管内皮细胞的有丝分裂、增生、迁移，并形成血管;②增加血管通透性，使血管芽延伸生长;③其受体在形成血管管腔时发挥效应。正常人体中可以存在血管内皮生长因子，我们研究正常子宫内膜中存在VEGF基因，由于月经周期变化，分泌期子宫内膜较增殖期内膜高，但两者之间无统计学意义。VEGF与其受体始终保持者平衡关系，当这种平衡被打破后则形成新生血管。在本实验中，异位内膜组织中的VEGF表达高于在位内膜和正常内膜，从而看到异位内膜更具有新生活力，才能在其部位形成病灶。VEGF基因在内异症中受多种因素、因子共同致病。VEGF在内异症中Ⅰ～Ⅱ期较Ⅲ～Ⅳ期阳性表达高，推断在早期内异症中在位的内膜受VEGF高表达使其内膜的活性更高，导致疾病更进一步发展。

垂体肿瘤转化基因(PTTG）是1997年Lin Pei［6］等利用差异显示PCR技术分离出来的，在体外将转染的PTTG成纤维细胞种植于无胸腺裸鼠皮下3周后形成肿瘤。利用原位杂交、免疫组化等技术发现PTTG位于细胞质，部分位于细胞核中。PTTG在大多数正常成人组织中检测不到，在高增殖活性的胚胎肝、胸腺、睾丸以及被研究的肿瘤细胞中呈高表达。PTTG高度表达在肿瘤发生的作用机制可能是：①导致细胞周期性增殖，通过SH－3介导的细胞内信号通路使细胞转化;②通过激活转染并反式激活细胞中的原癌基因发挥转录因子作用，致肿瘤形成;③PTTG蛋白抑制姐妹染色体单体分离，使染色体稳定性破坏，非整倍体形成的双重作用导致肿瘤形成;④可通过诱导P53的细胞凋亡，使基因调控区失常，导致肿瘤形成。⑤通过促进bFGF、VEGF参与的肿瘤血管生成［7］。

目前PTTG基因在EMs中的表达和意义与VEGF关系文献报道极少。通过本实验结果，推断PTTG与VEGF之间的关系：①PTTG高度表达可诱导EMs的血管新生。Ishikaw等［8］发现转染的NH 3T3细胞的培养液中VEGF表达增加，在体外实验表明，这种培养基在体外能诱导人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、毛细血管和管腔形成。在体内能诱导鸡胚绒毛膜尿囊膜形生轮辐状外观，是新生血管的表现。本实验中发现PTTGmRNA和PTTG蛋白表达在EMs中异位内膜组及在位内膜组中均有高度表达，正常内膜组有6例呈弱阳性表达。②Kim［9］等在甲状腺肿瘤中的实验中证实，ID 3 (血管生成基因）和VEGFmRNA的表达有关。利用外源性VEGF刺激FTC133细胞能够增强ID3和VEGF的表达，用TR－PCR等技术在研究中发现VEGF及其受体KDR/FIK－1含量比相应正常组织显著升高，与PTTG呈正相关。本实验中同样证实，EMs中PTTG mRNA及PTTG蛋白表达在异位内膜组、在位内膜组中有高度表达，并与VEGF表达在异位内膜组和在位内膜组呈正相关。进一步肯定PTTG高度表达可上调VEGF因子促进EMs血管生长并有侵袭和种植有关。但是PTTG mRNA和蛋白水平同时显示在Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期无明显差异，推测PTTG在内异症中不随期别的增加，而表达增高，可能是EMs中细胞分化正常，不同与恶性肿瘤细胞的分化。③EMs形成机制中可通过淋巴管通路形成微血管。研究中发现PTTG诱导VEGF高度表达的作用机制相同：MAPK级联活化增强PTTG反式激活作用，促进PTTG转移入核内，结合于VEGF转录起始位点，激活VEGF转录、翻译、促进肿瘤微血管生成。④在研究垂体肿瘤发生过程中，发现PTTG受雌激素调控，给予雌激素后PTTG表达水平以时间和剂量依赖性反式明显升高，并促使VEGF的表达。给予雌激素抗体时PTTG mRNA明显下降和肿瘤体积缩小。而本研究结果显示，在EMs中在位内膜中PTTG在增殖期与分泌期相比，差异无统计学意义，说明PTTG的表达不受卵巢性激素的影响。⑤近年来研究表明，MMP家族是一类蛋白水解酶，在EMs中血管形成和转移种植中不可缺少的一类细胞外基质重塑的因子。MMP和TIMP在EMs中的异常表达和EMs的发生发展有关，在裸鼠中注射了高度表达的PTTG的HEK293细胞，产生的肿瘤中MMP－2的表达、分泌及其功能比正常组织升高了，进一步加入MMP－2抗体后该作用显著下降了，由此推断PTTG可通过下调TIMP－1和TIMP－2的分泌来增强MMP－2的表达。

［1］王爽，张晓玲.Ang－2、VEGF在卵巢子宫内膜异位症中表达及相关性研究［J］.实用妇产科杂志，2010，26(8）：594～ 597.

［2］郎景和.子宫内膜异位症研究的深入和发展［J］.中华妇产科杂志，2010，45(4）：241～242.

［3］石一复，郝敏.子宫内膜异位症诊疗新进展［M］.人民军医出版社，2014.19～23.

［4］Machado DE，Berardo PT，Landgraf RG，etal.A selective cyclooxygenase－2 inhibitor suppresses the growth of endometrionsis with an antiangiogenic effect in a rat mode［J］.Fertil Steril，2010，93(8）：2674～2679.

［5］凌艳，刘阳.子宫内膜异位症中血管内皮生长因子、血管生成素－2与微血管密度的表达及临床意义［J］.中国妇幼保健，2014，29(2）：191～193.

［6］Pei L，Melmed S.Isolation and characterization of a pituitary tumortransforming gene(PTTG）［J］.Mol Endocrinol，1997，11(4）：433～441.

［7］Horwitz GA，Miklovsky 1，Heaney AP，et al，Human pituitary tumortransforming gene(PTTG1）motif suppresses prolactin expression［J］.Mol Endocrinol，2003，17(4）：600～609.

［8］Ishikawa H，Heaney AP，Yu R，et al.Human pituitary tumortransforming gene induces angiogenesis［J］.Clin Endocrinol Metab，2001，86(2）：867～874.

［9］Kim DS，Frank lyn JA，Stratford AL，et al.Pituitary tumortransforming gene regulates multiple downstream angiogenic genes in thyroid cancer［J］.Clin Endocrinol Metab，2006， 91 (3）：1119～1128.

The Expression and Significance of PTTG and VEGF in EMT

FAN Hong，SHAO Xuezhai，ZHANG Yujuan
(The Affiliated Hospital to Chengde Medical College，Hebei Chengde 067000，China）

Objective：To discuss the expression and correlation of PTTG and VEGF between ectopic EMT，EMT for patients with endometriosis and normal EMT for those without endometriosis.Method：Tobuild up one control group： 52 cases of ectopic EMT for patientswith endometriosis， 44 cases of EMT and 27 cases of normal EMT.Detecting the expression of PTTG and VEGF in 3 groups respectively，by way of RTPCR and SP.Result：The PTTGmRNA of ectopic EMT for patientswith endometriosiswas obviously higher than EMT and normal EMT group(P＜0.01），EMT was higher than normal EMT(P＜0.01）.Positive rate of PTTG protein expression for ectopic EMT，EMT and normal EMT group are 90%，79%and 22%respectively(P＜0.01）.Positive rate of VEGF protein expression for ectopic EMT，EMT and normal EMT group were 90%，84%and 59%respectively.A positive correlation was found between the expression of PTTG and VEGF.Conclusion：Both ectopic EMT and EMT group for patientswith endometriosis have the PTTGmRNA and PTTG protein expression;besides，expression of ectopic EMT for patients with endometriosis is higher than those in the EMT and normal EMT group;VEGF expression in the ectopic EMT group is higher than that in the EMT group;while the VEGF expression in the EMT group is higher than that in normal EMT group;PTTG high expression can raise VEGF high expression，PTTG and VEGF are positively correlated，which can promote the tumor angiogenesis and development of disease.

Endometriosis(EMT）;Pituitary tumor transforming gene(PTTG）;Vascular endothelial generated factor(VEGF）;Reverse transcription polymerase chain reaction(RT－PCR）;Immunohistochemical(SP）

A

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.06.006

1006－6233(2015）06－0897－05

*通讯作者，Email：zhangyj007@sin.cn