阿罗洛尔、普萘洛尔和卡维地洛对肝硬化大鼠门脉高压症的疗效比较

2015-06-23王晓艳万晓龙郭晓燕

西安交通大学学报（医学版） 2015年6期

关键词：阿罗卡维地洛门脉

王晓艳，万晓龙，郭晓燕，董蕾，秦斌，李晶

（西安交通大学医学部第二附属医院消化内科，陕西省肠胃动力疾病研究重点实验室，陕西省胃肠疾病临床研究中心，陕西西安 710004）

◇基础研究◇

阿罗洛尔、普萘洛尔和卡维地洛对肝硬化大鼠门脉高压症的疗效比较

王晓艳，万晓龙*，郭晓燕，董蕾，秦斌，李晶

（西安交通大学医学部第二附属医院消化内科，陕西省肠胃动力疾病研究重点实验室，陕西省胃肠疾病临床研究中心，陕西西安 710004）

目的探讨阿罗洛尔、普萘洛尔和卡维地洛降低肝硬化门脉高压症大鼠门静脉压力的疗效及相关机制，并对此3种药物的作用优劣作综合评估。方法CCl4诱导大鼠肝硬化门脉高压症模型，于模型稳定后分别给予阿罗洛尔、普萘洛尔、卡维地洛灌胃2周；插管法测平均动脉压（MAP）、心率（HR）及门静脉压力（PVP），免疫组织化学法测定肝组织中α-SMA表达；Masson染色法测胶原纤维面积。结果阿罗洛尔组和卡维地洛组PVP较模型组均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001），且两组PVP均低于普萘洛尔组（P＜0.001，P=0.032）；和模型组比较，阿罗洛尔组及卡维地洛组的MAP和HR均明显下降（P＜0.05）；卡维地洛组MAP较阿罗洛尔组更低（P=0.011）；普萘洛尔组仅MAP较模型组显著下降（P=0.003），而HR变化无统计学差异（P=0.143）。阿罗洛尔组和普萘洛尔组仅TBIL较模型组显著下降（P＜0.001），而卡维地洛组ALT、ALB、TBIL均较模型组明显改善（P＜0.001，P＜0.001，P= 0.045）；阿罗洛尔、卡维地洛、普萘洛尔组α-SMA表达及胶原纤维面积均较模型组减少，差别有统计学意义（P＜0.05）。结论阿罗洛尔能够显著降低肝硬化门脉高压症大鼠的门静脉压力，疗效与卡维地洛类似；在改善肝功能方面阿罗洛尔不及卡维地洛，但阿罗洛尔对MAP的影响要小于卡维地洛。

阿罗洛尔；卡维地洛；普萘洛尔；门脉高压症；大鼠

食管-胃底静脉曲张出血是肝硬化患者最常见的致死性并发症，年发病率为5%～15%［1］。降低门脉压力，预防和治疗肝硬化的并发症具有重要的临床意义。

非选择性β受体阻断剂被推荐用于预防静脉曲张患者的首次出血及再出血［2］。普萘洛尔是目前公认有效的降门脉压药物，但患者对其反应性低，使其临床应用受限。卡维地洛和阿罗洛尔同为第3代非选择性β受体阻滞剂，并具有微弱的α1受体拮抗作用。已有不少研究表明，卡维地洛可显著降低肝硬化患者门脉压力，且比普萘洛尔更加有效［3-7］。然而，目前关于阿罗洛尔对门脉压力作用的研究甚少。因此，本实验通过大鼠肝硬化门脉高压症模型中血流动力学指标、肝功能及肝纤维化指标的比较，探讨阿罗洛尔的降门脉压作用，并评价其与普萘洛尔、卡维地洛在肝硬化大鼠门脉高压症中的作用优劣，为临床寻求新的更加合理有效地降门脉压药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象及材料健康成年雄性SD大鼠54只［体质量（200±20）g］，购自西安交通大学医学部实验动物中心。

普萘洛尔（山西临汾云鹏药业有限公司生产）、卡维地洛（宁波市天衡制药有限公司生产）、阿罗洛尔（住友制药有限公司生产）均购自西安交通大学医学部第二附属医院。α-SMA免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔IgG多克隆抗体购自北京博奥森生物工程有限公司，Masson染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。血流动力学指标采用Power Lab4/ 20T（AD Instruments，由西安交通大学医学部机能实验中心提供）数据采集分析系统记录并分析。

1.2 造模及分组给药54只大鼠随机选取8只作为正常对照组，给予普通饲料、自由饮水，适应性饲养2周后取标本处死；余46只用于造模，普通饲料，自由饮水，并给予400 mL/L四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）橄榄油溶液腹腔注射，首次5 mL/kg，此后3 mL/kg，每周2次，共8周。造模期间死亡12只，于造模第6周将余下34只大鼠随机分为4组，模型组8只、普萘洛尔组8只、卡维地洛组9只、阿罗洛尔组9只，分别给予蒸馏水2 mL、普萘洛尔3.0 mg/kg、卡维地洛2.5 mg/kg、阿罗洛尔2.0 mg/kg，总量分2次每日灌胃，共2周。

1.3 血流动力学指标的测定由专人操作，术前禁食12 h，禁饮4 h，以200 g/L乌拉坦（1 g/kg，腹腔注射）麻醉，右颈总动脉插管（5号头皮针）测定平均动脉压和心率，上腹正中切口，门静脉插管（7号头皮针）测门静脉压力。待各观测指标稳定后由Power-Lab数据采集系统记录并分析。测压完毕后立即从门静脉采血，离心后取血清，-20℃贮存；取肝右叶组织，40 g/L多聚甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋。

1.4 血清生化指标的测定将离心所得血清送检西安交通大学医学部第一附属医院检验科，测定谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）。

1.5 肝组织病理学检查肝右叶组织常规石蜡包埋，4μm厚度连续切片，行HE染色和Masson三色染色。普通显微镜下观察HE染色后肝组织形态学变化。采用Image pro plus 6.0软件进行Masson染色结果的分析。Masson染色每张切片选取5个视野（×100），每个视野1 447 680μm2视场面积，结果表示为：胶原纤维面积百分比=胶原纤维着色面积/视场面积×100%，取平均值。

1.6 肝组织α-SMA免疫组化染色肝组织石蜡包埋块4μm连续切片，常规脱蜡至水，30 m L/L过氧化氢去除内源性过氧化物酶，室温置20 min，PBS冲洗，高压锅120℃修复4 min，PBS冲洗，滴加一抗（1∶800），4℃过夜，室温复温30 min，PBS冲洗，滴加生物素化二抗，37℃水浴30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用Image pro plus 6.0软件进行免疫组化结果分析，每张切片选5个视野（×400），每个视野选取1 447 680μm2视场面积，测定阳性面积百分比=阳性着色面积/视场面积×100%，平均吸光度值=累积吸光度（IA）/视场面积，取其平均值。

1.7 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理数据。实验结果以表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）检验，两组间比较使用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血流动力学指标的比较共7只大鼠因穿刺不成功或麻醉过深未测出，余结果如下：阿罗洛尔组PVP较模型组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001）；阿罗洛尔组PVP较普萘洛尔组更低（P＜0.001），而与卡维地洛组相比无统计学差异（P= 0.456）；和模型组比较，阿罗洛尔组及卡维地洛组的MAP和HR均明显下降（P＜0.05）；卡维地洛组MAP较阿罗洛尔组更低（P=0.011）；普萘洛尔组仅MAP较模型组显著下降（P=0.003），而HR变化无统计学差异（P=0.143，表1）。

表1 各组门静脉压力（PVP）、平均动脉压（MAP）及心率（HR）的测定结果Tab.1 The results of PVP，MAP and HR in each group（）

与模型组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与普萘洛尔组比较，&P＜0.05，ΔP＜0.01；与卡维地洛组比较，ψP＜0.05，θP＜0.01。

2.2 各组血清ALT、TBIL、ALB的测定结果比较卡维地洛组ALT、TBIL、ALB均较模型组明显改善（P＜0.01，P＜0.01，P=0.045）；阿罗洛尔组和普萘洛尔组仅TBIL较模型组显著下降（P＜0.05），两组间ALT、TBIL、ALB相比差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.3 各组肝脏组织病理形态的改变①HE染色结果。正常对照组肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，结构完整，无变性、坏死及炎性细胞浸润（图1 A）。模型组肝索排列紊乱，肝细胞可见脂肪变性、坏死，大量粗细不均的纤维条索分割包绕肝组织，广泛假小叶形成（图1B）。普萘洛尔组汇管区及肝小叶内可见较多淋巴细胞浸润，纤维组织增生明显，假小叶形成（图1C）。卡维地洛组和阿罗洛尔组肝细胞脂变、空泡形成较明显，部分假小叶消失（图1D）。②Masson染色结果。正常对照组胶原纤维仅见于管壁结构（图2A）；模型组胶原纤维增生明显，包绕假小叶周围（图2B）。普萘洛尔组假小叶结构明显，仍可见较多纤维沉积，但明显少于模型组（P＜0.001，图2C）；阿罗洛尔组及卡维地洛组胶原纤维沉积均较模型组和普萘洛尔组明显减少（P＜0.001）；卡维地洛组胶原纤维面积较阿罗洛尔组明显降低（P=0.01，表3）。③α-SMA表达的比较。正常对照组大鼠肝脏中α-SMA表达仅见于血管壁平滑肌细胞胞质，在肝窦及汇管区等均无表达（图3A）；模型组和各干预组α-SMA染色阳性细胞在纤维间隔中的细胞质和血管壁中均可见较多表达（图3）。阿罗洛尔组、卡维地洛组和普萘洛尔组α-SMA表达均较模型组明显减少，差别有统计学意义（P＜0.01）；阿罗洛尔组α-SMA的表达高于卡维地洛组（P=0.01），但较普萘洛尔组明显减少（P＜0.001，表3）。

表2 各组血清ALT、TBIL、ALB的测定结果Tab.2 The results of serum ALT，TBIL and ALB in each group（）

与模型组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与阿罗洛尔组比较，&P＜0.05，ΔP＜0.01。

表3 各组α-SMA的表达及Masson染色的结果Tab.3 The results ofα-SMA expression and Masson staining in each group（）

与模型组比较，*P＜0.01；与普萘洛尔组比较，#P＜0.01；与卡维地洛组比较，&P＜0.05，ΔP＜0.01。

图1 肝脏组织HE染色病理形态的变化Fig.1 Liver histopathological differences by HE staining（×100）A：正常对照组；B：模型组；C：普萘洛尔组；D：阿罗洛尔组。

图2 Masson染色各组胶原纤维的分布Fig.2 Distribution of collagen fibers in each group by Masson staining（×100）A：正常对照组；B：模型组；C：普萘洛尔组；D：阿罗洛尔组。

图3 各组α-SMA在肝脏组织中的表达Fig.3 The expression ofα-SMA in liver tissues in each group（×400）A：正常对照组；B：模型组；C：阿罗洛尔组；D：卡维地洛组。

3 讨论

非选择性β受体阻滞剂是预防食管静脉曲张患者首次出血及再出血的一线药物。但是，目前认为仅1/3～1/2的患者对其反应良好［8］。研究表明，肝硬化门脉高压症患者单独服用α1受体阻滞剂哌唑嗪后能够明显降低肝静脉压力梯度，但循环低血压、腹水的发生率增加，肾功能恶化［9］。当哌唑嗪与普萘洛尔联用后不仅有更强的降门脉压作用，而且对肾功能没有不良影响［10］，这为第3代非选择性β受体阻滞剂的临床应用提供了依据。已有不少研究证明阿罗洛尔用于治疗高血压患者降压疗效好，且没有肾功能损害［11-13］，对糖代谢无不良影响［14-15］。然而，阿罗洛尔降门脉压效果如何尚未可知。本实验通过动物模型测定阿罗洛尔干预后肝硬化门脉高压大鼠的门静脉压力，结果表明阿罗洛尔不仅能显著降低门静脉压力，且效果与卡维地洛相似，二者均优于普萘洛尔。

国内外较多研究［16-19］表明阿罗洛尔用于治疗轻、中度高血压疗效确切，有效率高。阿罗洛尔同时具有α1和β受体阻滞的作用，阻断β1受体使心率减慢，心输出量下降，循环血容量下降，血压降低；阻断α1受体，使血管舒张，外周阻力减小，血压进一步下降。本实验结果中阿罗洛尔组和卡维地洛组MAP均较模型组明显下降，但以卡维地洛对MAP的影响较大。可能原因为卡维地洛对α1受体的阻滞作用强于阿罗洛尔，其扩张血管作用更显著。TRIPATHI等［9］研究表明，卡维地洛12.5 mg/（kg·d）能够维持有效的降低门脉压力的作用，且不引起低血压，耐受性较好，而给患者服用卡维地洛25 mg/（kg·d）时，则引起明显的低血压，说明卡维地洛对血压的效应呈剂量依赖性。报道称阿罗洛尔对血压也具有相似的效应［20］。提示我们临床用药时应从小剂量开始，尽量减少副作用。

樊晓明等［21］研究称卡维地洛可以改善CCl4致大鼠的肝纤维化，可能机制为抑制肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化与增殖，抗氧化改善氧应激［22］，阻滞β受体等。目前，普遍认为HSC的活化与增殖是肝纤维化形成的中心环节［23-24］。研究资料表明交感神经系统的兴奋性增强可以促进肝纤维化的发生，且交感神经系统可能是通过作用于HSC而实现其对肝纤维化的调节［25-26］。本研究结果显示，阿罗洛尔组和卡维地洛组血清肝功能指标较模型组有所改善，Masson染色胶原纤维面积较模型组明显减少，说明非选择性β受体阻滞剂可能是通过降低交感神经系统的活性而抑制肝纤维化的形成。此外，阿罗洛尔、卡维地洛和普萘洛尔组α-SMA的表达均较模型组明显减少，提示三者均能够抑制HSC的活化，从而减少细胞外基质的沉积，达到改善肝纤维化的作用。而且，非选择性β受体阻滞剂还能抑制HSC的收缩［27-28］，降低肝窦内压，改善门静脉高压。

综上，本研究表明阿罗洛尔具有显著降低门静脉压力的作用，且优于普萘洛尔。在改善肝功能及肝组织学纤维化指标方面阿罗洛尔不及卡维地洛，但阿罗洛尔对MAP的影响要小于卡维地洛。目前仍需较多研究证实阿罗洛尔应用于门脉高压症患者的有效性和安全性，为临床上食管静脉曲张出血的治疗提供更多选择。

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（编辑韩维栋）

Therapeutic effects of arotinolol，propranolol and carvedilol on portal hypertension in cirrhotic rats

WANG Xiao-yan，WAN Xiao-long，GUO Xiao-yan，DONG Lei，QIN Bin，LI Jing
（Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center；Shaanxi Key Laboratory of Gastrointestinal Motility Disorders；Shaanxi Clinical Research Center of Gastrointestinal Disease，Xi’an 710004，China）

ObjectiveTo study the effects of arotinolol，propranolol and carvedilol on rat portal hypertension and make a comprehensive evaluation of the three drugs.MethodsPortal hypertension was induced with CCl4in rats.Arotinolol，propranolol，and carvedilol were administered for 2 weeks after the model was stable.Mean arterial pressure（MAP），heart rate（HR）and portal venous pressure（PVP）were measured at intubation；α-SMA expression was measured by immunohistochemistry；Masson staining was used to test collagen fibers area.ResultsCompared with model group，both arotinolol and carvedilol could significantly reduce PVP level（P＜0.001），which was lower than that in propranolol group（P＜0.001，P=0.032）.Compared with those in model group，both MAP and HR in arotinolol group and carvedilol group were significantly reduced（P＜0.05），MAP in carvedilol group was lower than in arotinolol group（P=0.011）.MAP was obviously decreased in propranolol group compared with model group（P=0.003），but HR had no sighificant difference between the two groups（P=0.143）.Only TBIL in arotinolol and propranolol groups reduced significantly compared with model group（P＜0.001）.However，ALT，ALB and TBIL were obviously ameliorated in carvedilol group compared with model group（P＜0.001，P＜0.001， P=0.045）.The expression ofα-SMA and the area of collagen fibers in arotinolol，carvedilol and propranolol groupssignificantly declined compared with those in model group（P＜0.05）.ConclusionArotinolol can significantly reduce cirrhotic rats'portal pressure，with effects similar to those of carvedilol.The effect of arotinolol in improving liver function is weaker than that of carvedilol，but the side effects on MAP are milder than those of carvedilol.

arotinolol；carvedilol；propranolol；portal hypertension；rat

R575.2

10.7652/jdyxb201506003

2014-11-12

2015-03-30

“十二五”国家科技支撑计划子课题资助项目（No.2012BAJ18B03-03）

Supported by the sub-program of“Twelve Fifth”National Science and Technology Plan Project（No.2012BAJ18B03-03）

董蕾.E-mail：dong556@126.com；*万晓龙并列第一作者.

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150720.1132.004.html（2015-07-20）