脑源性神经营养因子基因单核苷酸多态性与陕西汉族海洛因依赖群体的相关性研究

李云肖，殷芳圆，乔晓孟，魏曙光，赖江华

（西安交通大学医学部法医学院，陕西西安 710061）

◇临床研究◇

脑源性神经营养因子基因单核苷酸多态性与陕西汉族海洛因依赖群体的相关性研究

李云肖，殷芳圆，乔晓孟，魏曙光，赖江华

（西安交通大学医学部法医学院，陕西西安 710061）

目的探讨脑源性神经营养因子（BDNF）基因多态性与海洛因依赖的相关性。方法对符合纳入及排除标准的海洛因依赖组308例及健康对照组317例进行临床资料收集与血样采集。采用飞行时间质谱分析方法对BDNF rs16917204、rs6265、rs7103873、rs7103873、rs56164415、rs13306221、rs2030323共7个多态性位点进行分型，数据采用SPSS 20.0和HaploView 4.0软件进行统计学分析。结果rs6265位点基因型频率分布在海洛因依赖组及健康对照组中存在统计学差异（χ2=15.151，P=0.001）。与健康对照组相比，海洛因依赖组rs6265位点G等位基因频率显著高于健康对照组（χ2=9.864，P=0.002，OR=1.429，95%CI=1.143～1.786）。rs13306221位点基因型频率分布在海洛因依赖组及健康对照组中存在统计学差异（χ2=7.699，P=0.006）。与健康对照组相比，海洛因依赖组G等位基因频率显著高于健康对照组（χ2=7.137，P=0.008，OR=0.539，95%CI=0.340～0.853）。连锁不平衡检验发现，由rs6265与rs71038731（block1）构建的单倍型为强连锁不平衡（D’＞0.9；r2＞0.8）。在海洛因依赖组及健康对照组中，G-G单倍型频率分布存在显著性差异，健康对照组中G-G单倍型频率显著高于海洛因依赖组（χ2= 4.546，P=0.033）。结论BDNF基因rs6265及rs13306221多态性位点可能与海洛因依赖有关，携带有rs6265位点G等位基因及rs13306221位点G等位基因的个体更易形成海洛因依赖，携带有G-G单倍型（rs6265-rs71038731）的个体相对不易对海洛因产生依赖。

脑源性神经营养因子（BDNF）；海洛因依赖；单核苷酸多态性

毒品依赖是一种慢性复发性脑病，主要特征为渴求用药、戒断综合征、复发性、耐受性以及对药物产生敏化。目前，海洛因仍为我国主要滥用毒品之一，给社会带来巨大的经济损失。因此，对海洛因依赖病因的研究具有重要的医学和社会学意义。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotophic factor，BDNF）是脑内含量最多的神经营养因子，参与5-羟色胺和多巴胺能等多种神经元的生长、分化及损伤后修复［1-2］，而多巴胺边缘系统在药物依赖中有重要作用。因此，BDNF在药物依赖的发生、发展中扮演重要的角色。

BDNF基因位于11号染色体上，长67.17 kb，包含11个外显子，10个内含子。在BDNF基因和药物依赖的关联性研究中，关于基因多态性的研究结果并不一致。HAERIAN等［3］对BDNF基因与酒精、尼古丁、海洛因及甲基苯丙胺依赖的关联性研究进行了系统回顾及Meta分析，发现rs6265位点的G等位基因是南亚人群或中国人群海洛因及甲基苯丙胺依赖患者的危险等位基因。而MENG等［4］的研究结果表明，中国人群BDNF基因3个多态位点（rs10835210、rs16917234、rs6265）与药物依赖无显著性相关。此外，既往研究的样本量较小，如MARK等［5］研究的BDNF多态性与海洛因依赖关联分析中，海洛因依赖患者样本数为128个，CHENG等［6］的海洛因患者样本数为200个，KANAKO等［7］研究的甲基苯丙胺依赖患者数量为189个。

综上所述，BDNF基因对海洛因依赖具有重要作用，然而既往研究位点少，无法捕获全部有意义的单核苷酸多态性（SNP），且多态性研究结果矛盾。因此，对BDNF基因SNP位点进行系统筛选，进而对中国海洛因依赖人群进行相关性研究具有重要意义。我们所选的7个SNPs中，rs13306221、rs6265可能与物质依赖有关［8］，rs56164415可能影响BDNF表达，rs16917237、rs16917204可能与精神性疾病有关［9］，rs2030323可能与人性特征有关［10］，rs16917204-rs6265-rs7103873处于连锁不平衡状态［11］。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2007至2010年就诊于陕西精神卫生中心美沙酮门诊的海洛因依赖患者308例作为海洛因依赖组，平均年龄为（39.6±6.2）岁，均为男性。阿片类药物成瘾诊断是按照美国精神障碍诊断与统计手册第4版（DSM-IV）的诊断标准结合尿检及病史综合判断。纳入标准：大于等于18周岁；陕西汉族人；无亲缘关系；在西安精神卫生中心接受美沙酮维持治疗（MMT）至少半年；每天或几乎每天使用海洛因至少1年；在每年维护治疗之前，精神科医生要重新评估主要的精神和中枢神经系统疾病。病史采集包括：①使用海洛因的始发年龄和使用的持续时间；②海洛因使用剂量；③海洛因使用方式（鼻吸或注射）；④是否有其他物质依赖；⑤是否伴随其他精神性疾病。排除以下情况：有安非他明、巴比妥类药物、苯二氮卓类药物、大麻或其他可能影响中枢神经系统的药物使用史；酒精和尼古丁依赖史；有严重的躯体疾病、遗传性疾病、可能影响血液系统的疾病。

从西安交通大学医学部第一附属医院健康体检中心选取317例健康体检者作为对照组，均为陕西汉族男性，平均年龄（40.2±5.8）岁。收集其他药物使用史。排除有物质滥用史，参加其他研究或慢性神经系统疾病的患者。

1.2 方法EDTA抗凝真空采血管收集外周血3～5 m L，采用TIANamp Blood DNA Kit全血基因组DNA提取试剂盒（天根，中国北京）提取基因组DNA，-20℃储存备用。SNP分型由上海邃志生物科技有限公司利用美国Sequenom公司的Mass ARRAY系统完成，该系统是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF）。PCR反应条件：94℃15 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1 min，共45个循环；最终72℃3 min。该反应在37℃进行40 min，然后85℃5 min使酶失活。单碱基延伸反应在下列条件下进行：94℃30 s；94℃5 s，52℃5 s，80℃5 s 5个循环，共40个循环；最后72℃3 min。使用Mass ARRAY Nanodispenser（Sequenom）将最终的分型产物点样到一块384孔的spectro-CHIP（Sequenom）上。并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，最终结果由Mass ARRAY RT软件系统（版本号3.0.0.4）实时读取，并由Mass ARRAY Typer软件系统（版本号3.4）完成基因分型分析。单位点基因型峰图分辨率误差设定为≤0.000 1，总样本基因型峰图分辨率误差设定为≤0.001，从而使分型的可信度得到保证。分型后的样本每个基因型各随机抽取30个样本（10%）再次进行分型，以确保结果的可靠性。

1.3 统计学分析海洛因依赖组及健康对照组基因型哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg，H-W）检验采用GENEPOP v4.0，SPSS20软件计算病例组和对照组基因型频率和等位基因频率，Pearson’s卡方检验两组间等位基因频率和基因型频率分布差异。非线性logistic回归分析计算OR值（odds ratios）以及95%CI（95%confidence intervals）。多重检验采用Bonferroni法对检验水准P值进行校正，α值根据单点总数及单倍型SNP构成数进行设定。block根据D′＞0.9以及r2＞0.8进行定义。单倍型构建采用Haploview 4.0软件进行构建。频率＜5%的单倍型被排除不再进行统计学检验。Pearson’s卡方检验两组间单倍型频率及群体间差异分布。

2 结 果

BDNF基因7个SNP位点在海洛因依赖组及健康对照组的基因频率分布及关联性研究结果如下：海洛因依赖组及健康对照组BDNF基因7个SNP位点的基因频率分布均符合H-W平衡。1个block处于强连锁不平衡（D′＞0.9；r2＞0.8）：rs6265-rs7103873（block 1）。海洛因依赖组及健康对照组BDNF基因7个位点基因型频率、等位基因频率及单倍型分别见表1、表2。BDNF基因rs6265与rs13306221位点基因型海洛因摄入剂量比较，未发现有统计学差异，具体结果见表3。

单位点分析结果显示，在海洛因依赖组及健康对照组中，rs6265基因型频率分布存在统计学差异（χ2=15.151，P=0.001）。与健康对照组相比，海洛因依赖组的G等位基因频率显著高于健康对照组（χ2=9.864，P=0.002，OR=1.429，95%CI=1.143～1.786）。在海洛因依赖组及健康对照组中，rs13306221基因型频率分布存在统计学差异（χ2= 7.699，P=0.006）。与健康对照组相比，海洛因依赖组G等位基因频率显著高于健康对照组（χ2= 7.137，P=0.008，OR=0.539，95%CI=0.340～0.853），但Bonferroni法校正（α=0.007）后无统计学差异。由rs6265、rs7103873位点构建的（D′＞0.9；r2＞0.8）单倍型G-G频率分布在海洛因依赖组及健康对照组中存在差异，健康对照组G-G单倍型频率显著高于海洛因依赖组（P=0.033），但Bonferroni法校正（α=0.0167）后无统计学差异（图1）。

表1 BDNF基因型及等位基因频率在海洛因依赖组及健康对照组中的分布Tab.1 BDNF genotype and allele frequency distribution in heroin dependence group and control group

表2 BDNF基因在block 1中的单倍型频率及对海洛因依赖的风险Tab.2 BDNF gene in the haploid type in block 1 frequency and risk of heroin dependence

表3 BDNF基因rs6265与rs13306221位点基因型海洛因摄入剂量的比较Tab.3 Comparison of heroin intake dosage between BDNF gene rs6265 and rs13306221 site genotype

图1 BDNF基因2个SNP位点（rs6265-rs71038731）连锁不平衡结果Fig.1 Linkage disequilibrium results of 2 SNP loci（rs6265-rs71038731）of BDNF gene

3 讨 论

BDNF与中枢神经元突触可塑性密切相关，且与其他神经递质系统基因相互作用。BDNF对几个重要的神经传输系统的生存和传输有重要功能，如多巴胺能神经元，而这些神经传输系统可影响物质依赖。BDNF在磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3′-kinase，PI3K）、促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，CPLCγ）及核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NFκB）信号转导通路中起重要调节作用，从而影响大范围神经元的功能，包括神经元的生存、生长、分化、凋亡和结构。这些信号通路可影响药物依赖者的脑结构和行为可塑性，表明BDNF在脑的奖赏系统起着重要作用［12］，从而推测BDNF在药物依赖的发生发展中扮演重要作用。以上研究表明，BDNF基因是药物依赖的重要候选基因。

BDNF基因是海洛因等药物依赖的关键调节者。BDNF前体到成熟BDNF的裂解过程是脑内BDNF活性的关键程序。rs6265位点Met等位基因是一种特异的细胞内转导信号，可以有效地调节BDNF分拣和分泌。此等位基因影响海马神经细胞内信号转导过程，导致分拣BDNF前体到分泌这一路径的缺陷，从而减少总BDNF的分泌。低水平的BDNF有损记忆，增加神经精神性疾病的易感性，如抑郁性疾病和帕金森疾病［13］。相反，一些神经元刺激如甲基苯丙胺的使用，使携带G等位基因的人分泌较高水平的BDNF［14］。因此，G等位基因的携带者因脑内BDNF水平和活性的增加，而更易产生海洛因依赖。本研究结果显示，在海洛因依赖组中，BDNF基因rs6265位点G等位基因频率显著高于正常对照组，与之前报道结果一致［15］。如JIA等［16］对中国汉族人群的487例海洛因依赖患者的研究发现，与正常对照组相比，海洛因依赖组的rs6265位点G等位基因频率显著高于正常对照组，这与本研究结果一致。表明G等位基因携带者更易产生海洛因依赖，Val等位基因是药物依赖的风险因素，且相对A等位基因，G等位基因携带者可能有更高浓度的BDNF。与动物研究结果亦一致，在大鼠VTA中注射BDNF可引起长久的可卡因寻觅行为，而VTA是控制阿片类依赖开关的解剖区域，表明高浓度的BDNF易产生药物依赖，慢性药物暴露可增加VTA神经元的BDNF水平。此外，在VTA神经元中注射BDNF，可急剧地增加药物依赖的几个行为效应，包括行为敏化和觅药行为［17］。同样，在慢性吗啡暴露的戒断阶段，BDNF的mRNA显著、快速、持久地升高，此过程涉及戒断阶段的药物渴求想象［18］。亦有报道与此结果相反，如GREENWALD的研究［19］。有趣的是，该位点与酒精依赖无关。究其原因，海洛因成瘾是一个生理、心理、社会学因素综合作用形成的慢性复发性脑病，遗传因素外其他因素也有一定作用。在关联性研究中，药物种类、民族、地域、性别以及取样方法不同亦可造成结果的差异。本研究的308例海洛因依赖患者均来自中国西安，而GREENWALD等的128例海洛因依赖患者来自美国的底特律市。本研究的研究对象全部为男性，而GREENWALD的研究中男性占70%。此外，研究结果的差异也可能与形成海洛因依赖的起始年龄有关，如社会经济学状态、周围人的使用状况、药物的可及性、宗教信仰和父母对药物使用的态度均可影响开始使用药物年龄。无论是合法还是非法药物，第一次使用的年龄越早，形成药物成瘾的风险越大。因此，尚需进一步扩大样本量，通过对多个种群、多个基因和多个位点的研究，且控制其他可影响海洛因依赖的因素，从而探索海洛因依赖的遗传机制。

本研究结果显示，海洛因依赖组rs13306221位点等位基因G频率显著高于正常对照组，与之前报道在海洛因依赖人群中该位点G等位基因频率增加结果一致［8，20］。研究表明，位于BDNF基因启动子区rs13306221多态性可能改变聚合酶Ⅱ与启动子的亲和力，从而影响BDNF基因的转录启动效率。与A等位基因相比，G等位基因的转录活性显著降低［21］。然而，尚需更大样本量在其他民族与地域中进一步研究。

本研究又深入探索了这7个SNP位点之间的相互关系。连锁不平衡分析发现由rs6265-rs71038731构建的单倍型存在强连锁不平衡。单倍型分析显示，与对照组相比，海洛因依赖组G-G单倍型频率显著降低。此结果表明，携带BDNF基因的G-G单倍型的患者不易产生海洛因依赖。因此，该发现进一步支持了BDNF多态性在海洛因依赖中的作用。

总之，本遗传学研究有助于更好地理解海洛因依赖的潜在发病机制。研究表明了BDNF基因rs6265和rs13306221位点及其相关的单倍型在海洛因依赖的遗传易感性中可能发挥作用。这些SNPs是如何影响BDNF的功能尚待进一步的探讨。

［1］SPINA MB，SQUINTO SP，MILLER J，et al.Brain-derived neurotrophic factor protects dopamine neurons against 6-hydroxydopamine and N-methyl-4-phenylpyridinium ion toxicity：involvement of the glutathione system［J］.J Neurochem，1992，59（1）：99-106.

［2］蒋华玉，王永刚.血清脑源性神经营养因子水平与脑卒中后抑郁关系的Meta分析［J］.郑州大学学报：医学版，2014，49（5）：626-628.

［3］HAERIAN BS.BDNF rs6265 polymorphism and drug addiction：a systematic review and meta-analysis［J］.Pharmacogenomics，2013，14（16）：2055-2065.

［4］MENG C，LAN J，WANG Y，et al.Influence of brain-derived neurotrophic factor genetic polymorphisms on the ages of onset for heroin dependence in a Chinese population［J］.Genet Testing Mol Biomarkers，2012，16（9）：1044-1050.

［5］GREENWALD MK，STEINMILLER CL，SLIWERSKA E，et al.BDNF Val（66）Met genotype is associated with drug-seeking phenotypes in heroin-dependent individuals：a pilot study［J］. Addict Biol，2013，18（5）：836-845.

［6］CHENG CY，HONG CJ，YU YW，et al.Brain-derived neurotrophic factor（Val66Met）genetic polymorphism is associated with substance abuse in males［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，140（1-2）：86-90.

［7］ITOH K，HASHIMOTO K，SHIMIZU E，et al.Association study between brain-derived neurotrophic factor gene polymorphisms and methamphetamine abusers in Japan［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2005，132B（1）：70-73.

［8］JIA W，SHI JG，WU B，et al.Polymorphisms of brain-derived neurotrophic factor associated with heroin dependence［J］. Neurosci Lett，2011，495（3）：221-224.

［9］BORRONI B，GRASSI M，ARCHETTI S，et al.BDNF genetic variations increase the risk of Alzheimer's disease-related depression［J］.J Alzheimers Dis，2009，18（4）：867-875.

［10］KAZANTSEVA A，GAYSINA D，KUTLUMBETOVA Y，et al.Brain derived neurotrophic factor gene（BDNF）and personality traits：the modifying ef fect of season of birth and sex［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2015，56：58-65.

［11］YINLI C，JIE H，LI Z，et al.Association between brain-derived neurothropic factor variants and asthma in Chinese Han children［J］.Acta Paediatr，2013，102（6）：e247-250.

［12］RUSSO SJ，MAZEI-ROBISON MS，ABLES JL，et al.Neurotrophic factors and structural plasticity in addiction［J］.Neuropharmacology，2009，56（1）：73-82.

［13］KAMBEITZ JP，BHATTACHARYYA S，KAMBEITZ-ILANKOVIC LM，et al.Effect of BDNF val（66）met polymorphism on declarative memory and its neural substrate：a metaanalysis［J］.Neurosci Biobehav Rev，2012，36（9）：2165-2177.

［14］CHEN ZY，IERACI A，TENG H，et al.Sortilin controls intracellular sorting of brain-derived neurotrophic factor to the regulated secretory pathway［J］.J Neurosci，2005，25（26）：6156-6166.

［15］贾伟，师建国，吴斌，等.脑源性神经营养因子基因多态性与男性海洛因依赖的关联性研究［J］.中华精神科杂志，2011，44（3）：191-192.

［16］JIA W，SHI JG，WU B，et al.Polymorphisms of brain-derived neurotrophic factor associated with heroin dependence［J］. Neurosci Lett，2011，495（3）：221-224.

［17］LU L，DEMPSEY J，LIU SY，et al.A single infusion of brainderived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal［J］.J Neurosci，2004，24（7）：1604-1611.

［18］GEOFFROY HA，PUIGS，BENTURQUIA N，et al.Temporal regulation of peripheral BDNF levels during cocaine and morphine withdrawal：Comparison with a natural reward［J］. Int J Neuropsychopharmacol，2015，1-7.

［19］GREENWALD MK，STEINMILLER CL，SLIWERSKA E，et al.BDNF Val66Met genotype is associated with drug-seeking phenotypes in heroin-dependent individuals：a pilot study［J］. Addict Biol，2013，18（5）：836-845.

［20］杨亚鲜，陈燕祥，武健权，等.CNR1、GAD1和BDNF基因多态性与云南傣族男性海洛因依赖的相关性分析［J］.遗传，2014，36（9）：888-896.

［21］ZHANG H，OZBAY F，LAPPALAINEN J，et al.Brain derived neurotrophic factor（BDNF）gene variants and Alzheimer's disease，affective disorders，posttraumatic stress disorder，schizophrenia，and substance dependence［J］.Am J Med Genet Part B：Neuropsychiatric Genetics，2006，141（4）：387-393.

（编辑 卓选鹏）

Association of single nucleotide polymorphisms of brain-derived neurotrophic factor gene with heroin dependence in the Han population of Shaanxi Province

LI Yun-xiao，YIN Fang-yuan，QIAO Xiao-meng，WEI Shu-guang，LAI Jiang-hua
（Department of Forensic Science，Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710061，China）

ObjectiveTo examine the association between the polymorphisms of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）gene with heroin dependence.MethodsGenomic DNA was isolated from the venous blood leukocytes of 308 unrelated patients with heroin dependence and 317 healthy individuals.Seven single nucleotide polymorphisms（SNPs）were genotyped using MassARRAY system.Data were analyzed using Haplo View 4.0 and SPSS 20.0 software.ResultsThere was a significant dif ference in the genotype frequency of rs6265 between heroin dependence group and healthy control group（χ2=15.151，P=0.001）.The rs6265 G allele was significantly higher than in controls（χ2=9.864，P=0.002，OR=1.429，95%CI=1.143-1.786）.Furthermore，there was also a significant difference in the genotype frequency of rs13306221 between heroin dependence group and control group（χ2=7.699，P=0.006）.The rs13306221 G allele was significantly higher than in controls（χ2=7.137，P= 0.008，OR=0.539，95%CI=0.340-0.853）.Strong linkage disequilibrium（LD）was observed in one block（D'＞0.9；r2＞0.8），and significantly less G-G haplotype frequency of block 1（χ2=4.546；P=0.033）was found in heroin dependence group.ConclusionOur findings support the role of BDNF rs6265 and rs13306221 polymorphisms in heroin dependence and may guide future studies to identify other genetic risk factors for heroin dependence.

brain-derived neurotrophic factor（BDNF）；heroin dependence；single nucleotide polymorphism

R89

A

10.7652/jdyxb201506014

2014-11-19

2015-05-07

国家自然科学基金资助项目（No.NSFC 81172910）

Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.NSFC 81172910）

赖江华.E-mail：Laijh1011@mail.xjtu.edu.cn

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151014.1742.004.html（2015-10-14）