手性香料香芹酮和乙酸苏合香醋的液相色谱拆分及其对映体纯度测定

刘 慧,何津彦,阮源萍

(厦门大学化学化工学院,谱学分析与仪器教育部重点实验室,福建厦门361005)

手性香料香芹酮和乙酸苏合香醋的液相色谱拆分及其对映体纯度测定

刘 慧,何津彦,阮源萍*

(厦门大学化学化工学院,谱学分析与仪器教育部重点实验室,福建厦门361005)

香芹酮和乙酸苏合香醋是2种重要的食品用手性香料,它们的香味特征与其对映体构型及对映体含量有关.因此,对这类手性香料进行色谱拆分不仅在分析鉴定香料、开发食用香精配方、食品分析,而且在香料科学的基础研究方面也具有重要的意义.本研究采用新型的直链淀粉-三((S)-α-甲基苯基氨基甲酸醋)手性固定相(Chiralpak AS-H柱),系统考察了香芹酮、乙酸苏合香醋对映体的液相色谱拆分行为.实验表明:在该手性柱上,采用正己烷-异丙醇(体积比为95∶5)流动相,在10 min内,香芹酮和乙酸苏合香醋对映体即可获得很好的基线分离,分离度分别达到2.49和2.86;手性色谱分离为焓驱动过程;手性固定相侧链中α-甲基苯基手性中心可能对香芹酮的手性识别起到增强的作用.所建立的色谱分析方法准确、可靠、简便,可用于实际香料样品的对映体纯度分析.

香芹酮;乙酸苏合香醋;手性香料;对映体分离;高效液相色谱

手性香料是一类重要的化合物,不同对映体香料可能显示出不同的香气特征、香气强度和生物活性[1-4].香芹酮[美国食用香料与提取物制造者协会(FEMA)2249]和乙酸苏合香醋[FEMA 2684](见图1)各含有一个手性碳原子,是2种经美国FDA、欧洲理事会与食品香料专家委员会[2]和中国卫生部[5]批准的食品用手性香料.香芹酮对映体的香气有显著差异,(S)-(+)-香芹酮具有芫荽的香味,而(R)-(-)-香芹酮则有留兰香的香味[1-2].乙酸苏合香醋具有强烈的青香香味,其香味与所含对映体比例有关.如对映体过量值(ee)为78.3%的(S)-(-)-乙酸苏合香醋带有鳄梨的青味和草毒酱的香味;而ee为81.1%的(R)-(+)-乙酸苏合香醋带有杏香、苹果香和草毒酱香味[1,6].这2种香料的来源除了天然精油,也可采用生物合成或不对称合成技术获取[1-2,7-10].

由于手性在香料中的重要性日益受到重视,光活性的手性香料普及应用已经成为香料发展的必然趋势之一.因此,手性香料对映体拆分及其纯度分析在香料科学的基础研究与实际应用中具有重要的指导意义[1,7].而手性色谱被公认为测定对映体组成最为准确的方法之一[11].

图1 香芹酮(a)及乙酸苏合香醋(b)的化学结构式Fig.1 The chemistry structure of carvone(a) and styrallyl acetate(b)

香芹酮对映体可采用气相色谱和液相色谱[12]拆分,手性固定相多为环糊精衍生物.而乙酸苏合香醋可在一些糖基衍生物手性固定相,如Chiralcel OB[13]、Chiralcel OJ[14]和Chiralpak AD[15]柱上获得基线拆分.本文采用新型的直链淀粉-三((S)-α-甲基苯基氨基甲酸醋)(ASMBC)手性固定相(Chiralpak AS-H柱)[16-18],正己烷-醇流动相,系统考察香芹酮和乙酸苏合香醋的液相色谱拆分行为.在此基础上,建立一种准确、可靠、简便的测定香芹酮和乙酸苏合香醋对映体纯度方法,并应用于实际光活性香料样品的分析.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

日本岛津公司高效液相色谱仪:SCL-10 A系统控制器,DGU-12 A在线除气机,LC-10A TVP高压梯度泵,Rheodyne 7725i进样阀(20μL),CTO-10ASVP柱温箱,SPD-M10AVP二极管阵列检测器(190～370 nm),CLASS-VP色谱工作站(6.13 version).日本DAICEL公司的ASMBC手性色谱柱(Chiralpak ASH,4.6 mm(i.d.)×250 mm,5μm).

正己烷和乙醇为TEDIA(USA)HPLC级溶剂,异丙醇为Merck LiChrosolv(Germany)HPLC级溶剂.光活性香芹酮与乙酸苏合香醋参照品由厦门嘉盟刘刚博士提供.

1.2 色谱条件

采用Chiralpak AS-H手性柱为固定相,正己烷为流动相基础溶剂,乙醇或异丙醇为流动相极性调节剂,流速1.0 m L/min,柱温30℃,二极管阵列检测器190～370 nm.样品溶解在流动相中,进样体积20μL.采用在线UV光谱图对照鉴定目标对映体色谱峰,对映体的出峰顺序采用已知构型的光活性样品确定.

2 结果与讨论

2.1 流动相组成对色谱分离的影响

首先选用乙醇作为流动相极性调节剂,改变乙醇含量,考察香芹酮及乙酸苏合香醋在Chiralpak AS-H手性柱上的保留因子(k),对映体分离选择性(a)和分离度(Rs)的变化情况,结果见表1.随着流动相中乙醇含量的降低,它们的保留因子和分离度均明显增大.不同的是,该过程中香芹酮的对映体分离选择性变化不大,而乙酸苏合香醋的对映体分离选择性明显增加.相比之下,采用正己烷-乙醇流动相,乙酸苏合香醋容易达到基线分离,而香芹酮的分离度还有待于提高.

改用异丙醇作为极性调节剂,随着流动相中异丙醇含量的降低,香芹酮和乙酸苏合香醋的保留因子和分离度也明显增大,但对映体分离选择性变化不大.与相同比例的乙醇调节剂相比,采用异丙醇调节剂时的保留因子、对映体分离选择性和分离度均明显增加(见表1).特别是香芹酮对映体的拆分效果得到明显改善.采用正己烷-异丙醇(体积比为95∶5)流动相,香芹酮和乙酸苏合香醋在Chiralpak AS-H柱上均获得很好的基线分离(见图2),分离度分别达到2.49和2.86.但流动相中醇调节剂性质的改变并没有改变对映体的出峰顺序,香芹酮和乙酸苏合香醋均是(R)-构型对映体先出峰,(S)-构型对映体后出峰.

表1 流动相组成对香芹酮和乙酸苏合香醋色谱分离的影响Tab.1 Effect of composition of mobile phase on enantioseparation of carvone and styrallyl acetate

图2 香芹酮(a)和乙酸苏合香醋(b)的拆分色谱图Fig.2 Chromatograms of carvone(a) and styrallyl acetate(b)

2.2 色谱热力学与拆分机理探讨

开展色谱热力学实验,不但可以求解对映体在手性固定相上拆分过程中的热力学参数,而且有助于探究手性识别机理[19].在色谱手性拆分过程中,不同构型对映体的自由焓变(ΔH⊖)和自由熵变(ΔS⊖),以及它们在两相间分配的焓变(ΔΔH⊖)、熵变(ΔΔS⊖)之差,满足Van′t Hoff方程:

为此,采用正己烷-异丙醇(体积比为95∶5)流动相体系,在20～40℃范围内考察柱温对香芹酮和乙酸苏合香醋在Chiralpak AS-H柱上的色谱拆分行为的影响.结果表明:随着柱温的升高,香芹酮和乙酸苏合香醋的保留因子和对映体分离选择性均有所减小.基于Van′t Hoff方程,分别以ln k和lnα对1/T作图,结果参见图3.香芹酮和乙酸苏合香醋的Van′t Hoff曲线均呈现良好的线性(γ2＞0.985),说明在实验柱温范围内,ASMBC固定相的构型及香料对映体在Chiralpak AS-H柱上的手性识别机理未发生变化.通过曲线的斜率和截距等数据,可计算色谱拆分过程的热力学参数(表2).香芹酮和乙酸苏合香醋对映体的ΔH⊖为负值,说明溶质与固定相结合过程均为放热过程,且(S)-构型对映体放热更多,与固定相的结合在能量上更有利.香芹酮和乙酸苏合香醋的ΔΔH⊖和ΔΔS⊖均为负值,说明它们在Chiralpak AS-H柱上的手性拆分过程为焓驱动模式[19].

表2 香芹酮和乙酸苏合香醋色谱拆分的热力学参数Tab.2 Thermodynamic parameters for carvone and styrallyl acetate

Tamura等[12]曾报道:采用甲醇-水流动相,香芹酮在Chiralpak AD-RH柱上难于达到基线拆分.作者改用正己烷-异丙醇流动相,香芹酮在Chiralpak ADH柱上的拆分效果也没有得到明显的改善.与常见的ADMPC(Chiralpak AD-H柱)相比,ASMBC(Chiralpak AS-H柱)固定相侧链上多含一个手性中心,苯环与N—H基团不在同一平面,导致聚合物高级结构的改变,可能使手性拆分性能发生变化[16,18].虽然香芹酮分子只含有一酮基,但其手性中心在六元环上,分子结构扭曲且体积较小,有利于插入ASMBC的手性空穴内部,与手性固定相中的氨基甲酸醋残基发生较强的氢键作用或/和偶极-偶极作用,保留时间大于乙酸苏合香醋.由于受到侧链中α-甲基苯基立体构型的影响,ASMBC增大对香芹酮的手性识别能力.而乙酸苏合香醋分子含有淡基和苯环,分子刚性增大,它们可以与手性固定相中氨基甲酸醋残基和苯环氢键、偶极-偶极、π-π相互作用进行手性识别.这可能与乙酸苏合香醋在Chiralcel OB、Chiralcel OJ和Chiralpak AD的拆分机理是类似的.其中(S)-构型对映体与ASMBC的作用力大,保留时间长、后出峰.

图3 柱温对香芹酮(a)和乙酸苏合香醋(b)色谱拆分的影响Fig.3 Effect of temperature on enantioseparation of carvone(a)and styrallyl acetate(b)

2.3 实际样品测定

采用正己烷-异丙醇(体积比为95∶5)流动相,对一外消旋乙酸苏合香醋样品液平行进样6次进行精密度实验.结果表明:(R)-和(S)-乙酸苏合香醋的对映体峰面积比值为50.10∶49.90(相对标准偏差(RSD)≤0.03%),与外消旋化合物的理论值50∶50相符.采用优化后的色谱条件,对一些实际的光活性香料样品进行分析,结果见表3.结果表明:所建立的色谱分析方法具有良好的精密度及可靠性,可以快速准确地测定实际光活性香料样品的对映体纯度与香料构型.

表3 实际香料样品的色谱分析(n=3)Tab.3 The HPLC analysis of optical flavor samples(n=3)

3 结 论

本文采用新型的ASMBC手性固定相,正相色谱模式成功拆分了手性香料香芹酮和乙酸苏合香醋对映体.实验表明:采用正己烷-异丙醇(体积比为95∶5)流动相,香芹酮和乙酸苏合香醋对映体在Chiralpak AS-H手性柱上获得很好的基线分离;其手性色谱分离为焓驱动模式.由于ASMBC固定相侧链含有一个手性中心,它可以更有效地识别香芹酮手性分子.本文所建立的色谱分析方法准确、可靠、简便,适用于香芹酮和乙酸苏合香醋香料样品的对映体纯度分析.

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Liquid Chromatographic Resolution and Determination of Enantiomeric Purity of Chiral Flavors Carvone and Styrallyl Acetate

LIU Hui,HE Jin-yan,RUAN Yuan-ping*
(Key Laboratory of Spectrochemical Analysis&Instrumentation,Ministry of Education, College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

:Carvone and styrallyl acetate are two important chiral flavors in food additives.Their fragrance is related to their configurations and enantiomeric ratios.Therefore,the enantioseparation of these flavors is helpful to identify flavors and to develop flavor formula for food industry.In addition it is important in basic research of flavor science.In this paper,the high performance liquid chromatography enantioseparation of chiral carvone and styrallyl acetate was studied using amylose tris-(S)-α-methylbenzylcarbamate as the chiral stationary phase(Chiralpak AS-H column).The effects of alcohol content in the mobile phase and column temperature on the retention and enantioseparation were investigated.Additionally,the chiral recognition mechanism between the analytes and the chiral stationary phase(CSP)was discussed.The results show that baseline enantioseparations of carvone and styrallyl acetate are easily obtained in 10 min on that column with a mobile phase of n-hexane-isopropanol(95∶5,by vol.)at a flow rate of 1.0 m L/min under 30℃.The(R)-isomers are first eluted and the enantioseparation is typically enthalpy-controlled.The chiral center of α-methylbenzyl on CSP may strengthen the chiral recognition of carvone.The method established is simple,reliable and accurate,and has been successfully applied to determine enantiomeric purity of optical flavor samples.

carvone;styrallyl acetate;chiral flavors;enantioseparation;high performance liquid chromatography

O 657.72

A

0438-0479(2015)03-0310-05

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.003

2014-08-07 录用日期:2014-10-11

国家基础科学人才培养基金(J1310024)

*通信作者:ypruan@xmu.edu.cn

刘慧,何津彦,阮源萍.手性香料香芹酮和乙酸苏合香醋的液相色谱拆分及其对映体纯度测定[J].厦门大学学报:自然科学版,2015,54(3):310-314.

:Liu Hui,He Jinyan,Ruan Yuanping.Liquid chromatographic resolution and determination of enantiomeric purity of chiral flavors carvone and styrallyl acetate[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(3):310-314.(in Chinese)