牙鲆早期胚胎发育的盐度胁迫研究

段秀娟　马玉和　任延军

摘 要：研究了盐度对牙鲆受精卵的沉浮性及早期胚胎发育的影响。结果表明：受精卵在海水盐度30以上为浮性，盐度27.5时为悬浮，盐度25以下为沉性；孵化期适盐范围为25～45，最适盐度范围为30～35；在盐度15～20和45～50下，牙鲆受精卵孵化率显著下降，仔鱼的畸形率大幅上升；牙鲆原肠期对盐度变化的耐受力高于囊胚期，囊胚期高于4细胞期。

关键词：牙鲆；盐度；早期；胚胎发育

中图分类号：S917 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.010

Abstract： The effect of different salinity on floating natures and early embryo development of fertilized eggs from Paralichthys olivaceus breed in sea water were studied. The research results showed that fertilized eggs floating in seawater with salinity above 30， 27.5 as a state of suspension， sinking under the salinity 25. Suitable salinity ranged from 25 to 45 in incubation period， and the optimum salinity ranged from 30 to 35. Hatching rate of fertilized eggs dropped significantly and deformity rate rose in juveniles with the salinity 15 ～ 20 and 45 ～ 50. The tolerance from salinity variation in gastrula stage was better than blastula stage and the blastula stage was better than 4 cells stage.

Key words： Paralichthys olivaceus； salinity； early stage； embryo development

盐度是影响海水鱼类胚胎和初孵仔鱼生长、发育的重要因素，不同种类的胚胎和初孵仔鱼的盐度耐受力不同，因此，研究适宜的环境盐度条件对于鱼类的孵化和培育具有重要意义。目前已大量报道了盐度对鱼类胚胎发育和仔鱼生长及存活的影响[1-6]。雷霁霖等[1]用人工配制的不同盐度海水培养黑鲷（Sparus macrocephalus）受精卵，对其胚胎发育、仔鱼孵化和卵黄囊消失等方面进行了观察研究，为鲷科鱼类的人工育苗积累了技术参数；王国恩[7]研究了盐度对鳀属（Coilia nasus）胚胎发育和孵化的影响；孙丽华等[8]报道了盐度对军曹鱼（Rachycentron canadum）胚胎和仔鱼发育的影响；王涵生等[9]研究了温度、盐度对牙鲆受精卵孵化率及仔鱼存活率的影响；王宏田等[10]研究了牙鲆的胚胎发育以及初孵仔鱼的盐度耐受力。但关于盐度对各阶段牙鲆胚胎发育的影响尚未见报道。在实际生产中，由于降水、蒸发等原因导致的海水盐度变化时有发生，对发育中的牙鲆胚胎将会产生影响，应对此影响进行深入的了解和评估，本试验以牙鲆胚胎为材料，研究盐度对其胚胎不同发育阶段的影响，旨在为牙鲆苗种培育提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

雌雄亲鱼均为5龄，雌鱼体长55 cm，体质量约2 550 g，雄鱼体长45 cm，体重约1 850 g。试验鱼卵采自同一尾雌鱼，约36 000粒，精子采自一尾雄鱼，约3.0 mL。经人工授精获得受精卵。

配置盐度5，10，15，20，25，30，35，40，45和50的海水，pH值为7.8～8.2，水温15.5～17 ℃。

1.2 试验方法

1.2.1 人工受精 采用干法授精，将采集的精子经镜检确认活力好后加入放有牙鲆卵的烧杯中，轻轻晃动烧杯使精卵混合，加入16 ℃海水200 mL激活受精，2 min后加入500 mL海水稀释受精卵，待受精卵充分上浮后，过滤并用海水冲洗数次，受精卵放入网箱（孔径为0.19 mm）中，孵化盐度为33。

1.2.2 胚胎的沉浮性及胚胎的盐度耐受力 用6个1 000 mL的烧杯分别装入盐度为20，22.5，25，27.5，30，32.5的海水1 000 mL，每个烧杯中放入100粒牙鲆受精卵，静置30 min，观察其沉浮。试验设3个平行。

设置5，10，15，20，25，30，35，40，45，50共10个盐度梯度，每个盐度梯度各设3个平行，每个平行水体为20 cm×20 cm×10 cm。当受精卵发育到4细胞、囊胚期和原肠期时，分别放到10个盐度梯度试验组中孵化，每组200粒卵。

显微观察胚胎发育，各组达到原肠期后，从受精卵中随机抽取200粒，统计受精率；至完全孵化，统计孵化率、畸形率。

1.2.3 数据处理 受精率=原肠期时正常胚胎数/总卵数×100%；孵化率=初孵仔鱼数/受精卵数×100%；畸形率=畸形仔鱼数/初孵仔鱼总数×100%。

试验数据利用SPSS11.5进行单向方差分析（One way ANOVA），对不同数据组之间均值利用LSD做差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 受精卵的沉浮性

水温15.5～17.5 ℃时，海水盐度25以下受精卵表现为完全沉性；盐度27.5时表现为半沉浮状态，大部分受精卵悬浮于水体中间；盐度30以上则表现为完全浮性。

2.2 盐度对各期胚胎发育及孵化的影响

2.2.1 盐度对4细胞胚胎孵化的影响 4细胞时，牙鲆受精卵的孵化率见表1。盐度30～40，3个试验组的平均孵化率最高达91%。盐度30，35，40时，孵化率无显著差异；盐度25和45时孵化率无显著差异；盐度25和50时孵化率无显著差异；盐度15和20时孵化率无显著差异；盐度为25和45时，各组受精卵的孵化率较盐度30～40时降低12%～23%；25和50盐度组的孵化率降幅为18%～26%；15和20盐度组的孵化率降幅为17%～45%；而5盐度组的孵化率为0。

2.2.2 盐度对囊胚期胚胎孵化的影响 如表2所示，囊胚置入不同盐度海水中，盐度30～40范围内3个试验组的平均孵化率最高达93%。30，35，40这3个盐度组之间孵化率无显著差异；25和45盐度组之间孵化率无显著差异；40和45盐度组之间孵化率无显著差异；盐度为15，20， 25，50时，各组受精卵的孵化率较盐度30～40时降低17%～37%；而5盐度组的孵化率为0.12%。

2.2.3 盐度对原肠期胚胎发育及孵化的影响 如表3，原肠期牙鲆胚胎置入不同盐度海水中，盐度30～45范围内4个试验组的平均孵化率最高达96%。30，35，40，45这4个盐度组之间孵化率无显著差异；25和50盐度组之间孵化率无显著差异；15和20盐度组之间孵化率无显著差异；盐度为25和50时，各组受精卵的孵化率较盐度30～45时降低16%～26%；15和20盐度组的孵化率降幅为39%～44%；而5盐度组的孵化率为2.74%。

2.2.4 各个胚胎发育时期孵化率的比较 如图1，牙鲆的适宜孵化盐度范围为25～45，最适孵化盐度范围为30～35。在最适孵化盐度范围内，4细胞、囊胚期、原肠期的孵化率分别为83.56%～90.52%、84.83%～92.32%、87.70%～95.15%，4细胞、囊胚期、原肠期对盐度的耐受力逐渐增强。

2.2.5 盐度与牙鲆初孵仔鱼的畸形率 如表4，3个平行组中牙鲆初孵仔鱼的畸形率均在30～35范围内最低，30，35 ，40这3个盐度组之间畸形率无显著差异；盐度低于25和高于40时畸形率随盐度进一步降低或升高而显著升高。

3 结论与讨论

3.1 盐度与受精卵的沉浮性

牙鲆受精卵具有典型硬骨鱼类浮性卵的特性，中央油球能使卵子漂浮于一定盐度的海水中。其沉浮性与黑鲷、真鲷等海水鱼类受精卵在不同盐度的沉浮状态相似[11]，但与其他海水鱼类胚胎发育的适盐范围差别较显著（表5）。

3.2 盐度与早期胚胎发育

牙鲆胚胎发育的最适盐度范围为30～35，适宜盐度范围为25～45。而盐度15～20和45～50可分别视为牙鲆受精卵孵化在低盐区和高盐区的两个临界盐度区域，在此临界盐度上下，牙鲆受精卵孵化率和仔鱼畸形率均表现出明显的不同。因此，在牙鲆人工繁殖时，海水盐度低于25时，要适当调高孵化水盐度，并保持连续充气，使卵子处于悬浮状态[16]。

另外，鱼类孵化适宜盐度范围不仅具有种间差别（表5），且与其各自的生态习性有关，如尖吻鲈为广盐性鱼类，人工繁殖时受精卵孵化率在盐度11～40范围内均无显著差别；真鲷和高体狮均是外海洄游性鱼类，但真鲷的最适孵化盐度范围为28.1～32.7，而高体狮孵化的最适范围比较窄，仅为32～35[17]。牙鲆亦属外海洄游性鱼类，Ditty 等调查墨西哥湾自然海区中牙鲆卵主要分布于盐度28.5～34.1区域，这与大亚湾海区人工培育的牙鲆受精卵孵化的最适盐度范围相近。

3.3 盐度与牙鲆受精卵的孵化率

试验观察发现，在盐度为25～45的范围内，牙鲆受精卵保持着较高的孵化率，但孵化速度不同，在盐度为25和40时，孵化速度较快，因此，牙鲆受精卵孵化时对盐度的适应性很强。在25～45的盐度范围内牙鲆受精卵的发育时序、孵化率无显著差别，受精卵的胚胎发育基本不受盐度影响，这为牙鲆的人工育苗提供了宽松的盐度要求。

在不同盐度下，原肠期牙鲆胚胎孵化率均高于4细胞和囊胚期，原肠期对盐度的耐受力更强，与朱鑫华等人的研究结果基本一致[18]。大菱鲆胚胎在原肠后期会出现大量死亡，牙鲆胚胎的生命力较强，保持水温稳定和水质良好不会轻易死亡。牙鲆胚胎对盐度的耐受力随着发育时期的推进而增加，原肠期对盐度变化的耐受力高于囊胚，越接近胚胎发育的后期，对盐度变化的适应力也越强。

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