菊花中绿原酸超声提取工艺与测定方法研究

司超+姚晓芹+贺学礼+楚建周

摘要：采用正交试验，考察提取显色条件对药用菊花中绿原酸提取与测定的影响。结果表明，菊花中绿原酸提取测定最优方法为用80%甲醇作提取剂，超声提取30 min，加0.02 mol/L FeCl3 0.5 mL进行显色反应，静置30 min后在分光光度计755 nm波长下测定吸光度，该方法简单、准确、灵敏、重复性强，可用于菊花中绿原酸的提取测定。

关键词：菊花;绿原酸;超声提取;分光光度法

中图分类号： R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0264-03

收稿日期：2014-05-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：31300321）;河北省自然科学基金（编号：C2012201080）;河北大学大学生科技创新项目（编号：2013080）。

作者简介：司 超（1985—），女，山东滕州人，硕士研究生，主要从事药用植物次生代谢研究。E-mail：sisi19851204@163.com。

通信作者：姚晓芹，博士，副教授，主要从事药用植物次生代谢、植物逆境生理研究。E-mail：yaoxiao301@126.com。

菊花为多年生菊科草本植物，以头状花序入药，是我国传统中药，主要功效有散风清热、平肝明目、解毒、降压等，主治风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、明目昏花等症[1]。绿原酸是菊花主要的活性成分，它是植物体在有氧呼吸过程中合成的一种苯丙素类物质，具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利胆等多种功效[2-3]。目前，提取药用植物中绿原酸采用的方法主要有超高压提取法、热回流法、溶剂浸提法、酶解法、微波辅助萃取法、超声提取法等[4-7]。绿原酸含量测定方法主要有高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、紫外分光光度法等[8-10]。有学者利用可见分光光度法测定绿原酸含量，该方法主要是利用绿原酸能与FeCl3进行特殊的显色反应来测定植物中绿原酸含量，具有原理简单、仪器常见、成本低等优点[11]。笔者在前人研究的基础上对超声提取、显色条件进行深入研究，进一步完善采用可见分光光度法快速测定植物中绿原酸含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器：722型可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），240W PS-40A型数控超声波清洗器（深圳市康洁洗净电器有限公司）。主要试剂：标准绿原酸（纯度95%，阿拉丁试剂上海有限公司）、FeCl3溶液、甲醇、乙醇。笔者所在实验室种植的怀菊，将菊花头状花序在105 ℃下杀青30 min，55～60 ℃下烘干至恒质量，粉碎、过筛，混匀备用。

1.2 超声波提取条件优化

1.2.1 提取溶剂 用60%甲醇、60%乙醇进行提取溶剂试验，比较不同提取剂对绿原酸提取效果的影响。取0.3 g干样，分别加入15 mL 60%甲醇、15 mL 60%乙醇溶液，超声提取30 min，过滤后用提取溶剂定容至25 mL刻度管内;取1 mL上述溶液加4 mL提取溶剂，置于10 mL刻度管中，加0.5 mL 0.02 mol/L FeCl3溶液（分别用60%甲醇、60%乙醇配制）振荡摇匀后静置60 min，用722型分光光度计于755 nm波长下进行比色，确定最佳提取溶剂。

1.2.2 提取容器 选择等容积的烧杯、锥形瓶、塑料瓶、试管进行试验，提取溶剂为60%甲醇溶液，提取方法、测定步骤同“1.2.1”节，比较提取容器对绿原酸提取效果的影响。

1.2.3 浸泡时间 用甲醇提取液分别浸泡样品0、3、6、12、18、24 h后进行超声提取，测定方法同“1.2.1”节，比较浸泡时间对绿原酸提取效果的影响。

1.2.4 提取时间 用甲醇提取液分别超声提取样品10、20、30、40、50、60 min，测定方法同“1.2.1”节，比较超声提取时间对绿原酸提取效果的影响。

1.2.5 提取次数 用甲醇提取液分别经超声波提取样品1、2、3、4次，每次时间10 min，每次加入最佳提取溶剂5 mL，提取完成后合并每次的提取液，过滤并定容，测定方法同“1.2.1”节，比较提取次数对绿原酸提取效果的影响。

1.2.6 提取溶剂浓度 分别用20%、40%、60%、80%、100%甲醇溶液提取样品，其他条件为已选出的最佳条件，测定方法同“1.2.1”节方法，比较不同浓度甲醇提取液对绿原酸提取效果的影响。

1.3 显色条件优化

配制0.01、0.02、0.03 mol/L FeCl3-甲醇显色溶液，显色时分别在样品液中加入0.5、1.0 mL进行试验，提取条件采用“1.2”节的优化条件。

1.4 正交试验

在提取、显色条件优化试验结果基础上设计正交试验，选出最优水平组合。选取对测定结果影响较大的2个因素，即提取剂浓度、显色剂用量进行正交试验。

1.5 标准溶液的配制

准确称取绿原酸对照品10 mg，加入最佳提取溶剂溶解并定容至50 mL，制成200 μg/mL标准液。在7个10 mL刻度管内分别加入0、1、2、3、4、5、6 mL标准贮备液，用80%甲醇稀释至标线，分别制成0、20、40、60、80、100、120 μg/mL标准液。按“1.3”节优化结果进行显色、测定。

2 结果与分析

2.1 超声波提取条件优化

2.1.1 提取溶剂对绿原酸提取效果的影响 绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，分子结构中有酯键、不饱和双键、多元酚3个不稳定部分，可以利用甲醇、丙酮、乙醇等极性溶剂从植物中提取出来。笔者分别以甲醇、乙醇为提取溶剂进行试验，试验过程中发现，以乙醇为提取剂在显示过程中容易出现沉淀，因此下面其他优化试验都用甲醇作为提取溶剂。endprint

2.1.2 提取容器对绿原酸提取效果的影响 由表1可知，试管提取效果最佳，另外，利用试管作为提取容器操作更方便。因此，本试验选用试管作为提取容器。

表1 不同容器对绿原酸提取效果的影响

容器 D755nm

烧 杯 0.188±0.005b

锥形瓶 0.181±0.007ab

塑料瓶 0.189±0.009ab

试 管 0.211±0.004a

注：同列数据后标有不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下表同。

2.1.3 样品浸泡时间、提取时间、提取次数对绿原酸提取效果的影响 由表2至表4可知，浸泡时间、提取时间、提取次数3个因素对绿原酸提取没有显著影响，因此选择不浸泡，超声提取1次，提取时间为30 min。

2.1.4 提取溶剂浓度对绿原酸提取效果的影响 由表5可知，甲醇浓度对菊花中绿原酸的提取效果有显著影响。提取

表2 浸泡时间对绿原酸提取效果的影响

浸泡时间（h） D755 nm

24 0.157±0.009b

18 0.162±0.004ab

12 0.166±0.002ab

6 0.168±0.003ab

3 0.167±0.003ab

0 0.178±0.003a

表3 提取时间对绿原酸提取效果的影响

提取时间（min） D755 nm

60 0.213±0.002a

50 0.192±0.011a

40 0.195±0.008a

30 0.202±0.003a

20 0.184±0.010a

10 0.205±0.006a

表4 提取次数对绿原酸提取效果的影响

提取次数（次） D755 nm

4 0.189±0.002a

3 0.183±0.002a

2 0.163±0.004b

1 0.160±0.007b

液吸光度随甲醇浓度的增加而增大。当甲醇浓度≤60%时，提取液吸光度随着浓度的增加变化比较剧烈，当甲醇浓度>60%时，提取液吸光度变化比较平缓，并且80%、100%甲醇处理对绿原酸的提取效果差异不显著。

表5 提取溶剂浓度对绿原酸提取效果的影响

甲醇浓度（%） D755 nm

20 0.028±0.003d

40 0.078±0.006c

60 0.195±0.004b

80 0.218±0.000a

100 0.222±0.003a

2.2 显色条件优化

表6表明，当显色剂浓度为0.01 mol/L、用量为0.5 mL时，样品产生沉淀，这可能是因为FeCl3含量不足;当显色剂浓度为0.02 mol/L、用量为0.5 mL时，吸光度最大;当显色剂浓度为0.03 mol/L时，吸光度显著降低。

表6 显色剂浓度及用量对绿原酸提取效果的影响

显色剂浓度

（mol/L） 显色剂用量

（mL） D755 nm

0.01 0.5 0（沉淀）

1.0 0.165±0.004b

0.02 0.5 0.182±0.004a

1.0 0.101±0.002d

0.03 0.5 0.136±0.003c

1.0 0.077±0.001e

2.3 正交试验结果

选取对绿原酸提取、显色影响明显的因子进行正交试验。以提取剂浓度、0.02 mol/L显色剂FeCl3的用量为考察因素，设计正交试验 （表7、表8）。由此可知，最优水平组合为A2B2，即甲醇浓度80%，显色剂用量0.5 mL。

表7 正交试验因素水平

水平

因素

A：提取剂浓度（%） B：显色剂用量（mL）

1 60 0.25

2 80 0.50

3 100 0.75

4 1.00

表8 正交试验结果与极差分析

序号

因素水平

A：提取剂浓度 B：显色剂用量

吸光度

1 1 1 0（沉淀）

2 1 2 0.206±0.001d

3 1 3 0.170±0.002e

4 1 4 0.154±0.002f

5 2 1 0.269±0.004a

6 2 2 0.239±0.003b

7 2 3 0.224±0.002c

8 2 4 0.217±0.003c

9 3 1 0.240±0.004b

10 3 2 0.239±0.003b

11 3 3 0.240±0.004b

12 3 4 0.237±0.005b

k1 0.177 0.127

k2 0.316 0.171

k3 0.319 0.159

k4 0.152

极差R 0.142 0.044

2.4 标准曲线

取不同浓度标准液5 mL，加入显色剂FeCl3-甲醇溶液0.25 mL充分振荡，静置30 min后于波长755 nm下比色，以80%甲醇加显色剂作参比调零。以吸光度为纵坐标、相对应的绿原酸浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为y=0.002 3x-0.010 4，r2=0.995 9（图1）。endprint

2.5 加标回收率

称取菊花干样粉末6份，每份0.3 g，按正交试验筛选出的最优条件进行提取，取6支试管，分别加入提取液0.5 mL、60 μg/mL标液0.5 mL，定容至5 mL，加0.25 mL显色剂进行显色，利用分光光度分析加标率直接计算数学模型[12]，得出平均回收率为100.83%。

2.6 精密度

对120 μg/mL标准溶液连续测定20次，测得样品中绿原酸吸光度RSD值为0.22%，符合相关规定，表明试验精密度很好。

2.7 重复性

称取5份样品，每份0.3 g，按照优化条件进行提取测定。经计算RSD值为1.10%，表明试验重复性符合有关规定。

3 结论

与常规提取方法相比，超声波提取法具有操作简单、溶剂用量少、提取时间短、对环境污染小、被提取活性物质不易被破坏、提取率较高等优点[13]。酚类物质与FeCl3发生显色反应，能够用来检验酚羟基的存在，并对绿原酸进行简单快速的定量分析[14]。本试验综合考虑了与测定相关的提取及显色因子，结果表明，菊花中绿原酸提取测定最优方法为用80%甲醇作提取剂，超声提取30 min，加0.02 mol/L FeCl3 0.5 mL 进行显色反应，静置30 min后，在可见分光光度计 755 nm 波长下测定吸光度。本方法成本低、简便易操作、精密度好、重复性强，可用于菊花中绿原酸的提取测定。

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