白芨种子无菌萌发特性

李雨晴+杨嘉伟+王康才+梁永富+陈红丽+徐益祥+夏天爽

摘要：为探讨白芨[B.striata（Thunb.）Teichb.f.]种子无菌萌发适宜条件，采用1/2 MS、MS添加不同激素、生物添加剂，以及光暗处理进行白芨种子萌发试验。结果表明：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA有利于种子萌发;1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁有利于诱导原球茎;暗培养降低白芨种子萌发率，白芨种子萌发后，其幼苗在光照条件下生长缓慢。

关键词：白芨;无菌萌发;发芽势;

中图分类号： S567.23+9.04 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0253-02

收稿日期：2014-05-22

基金项目：江苏省镇江市农业项目（编号：R0201100292）。

作者简介：李雨晴（1991—），女，硕士研究生，主要从事药用植物栽培与生理研究。E-mail：2013804133@njau.edu.cn。

通信作者：王康才，教授，主要从事药用植物栽培与生理研究。E-mail：wangkc@njau.edu.cn。

白芨[Bletilla striata （Thunb.）Teichb.f.]为兰科白芨属多年生草本植物，以干燥块茎入药，性微寒，味苦、甘、涩，具有补肺、止血、散风除湿、通窍止痛、消肿排脓、生肌、敛疮等功效，主治咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肺结核咳血、溃疡病出血等症[1]。白芨种子细小、无胚，在野生条件下很难萌发。人工采挖导致白芨野生资源紧缺，迫切需要进行人工栽培。白芨蒴果包含上万粒种子，利用组织培养技术对白芨进行无菌萌发，可以提高其萌发率，得到大量组培苗，是解决传统分株繁殖效率低的重要手段[2-5]。为进一步优化白芨种子的发芽条件，本研究探讨白芨无菌萌发条件及幼苗生长特性，以期为白芨快速繁殖提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

白芨于2013年8月采自南京农业大学中药材试验大棚，经南京农业大学中药材研究所王康才教授鉴定为白芨的蒴果。

1.2 方法

白芨蒴果采集后，先用洗涤剂漂洗蒴果表面，再用流水冲洗30 min。在超净工作台上用75%乙醇浸没30 s，无菌水冲洗后经HgCl2消毒15 min，其间不停摇动，无菌水冲洗3～4遍，用无菌滤纸吸干白芨蒴果表面水分。蒴果纵剖，将种子均匀抖落在培养基表面。基本培养基为1/2 MS，均添加蔗糖 30 g/L、琼脂粉6 g/L（除特殊说明而外）。培养基灭菌前加入不同生物添加剂（马铃薯提取液、椰汁）以及不同浓度激素（NAA、6-BA），设置5×5完全随机区组。培养基高温灭菌前调节pH值至5.6，121 ℃下灭菌30 min，每处理接种5瓶，每瓶300～400粒种子。暗培养以黑暗条件下培养30 d后置于光下，其余处理为12 h/12 h光暗培养，照度2 000～2 500 lx，培养温度均为（25±1） ℃。统计各处理白芨种子发芽率、发芽势，原球茎诱导率及株高。发芽势以培养20 d时的萌发率计，幼苗株高以培养50 d时计。

1.3 数据分析

用SPSS软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 不同处理下白芨种子萌发、幼苗发育过程

白芨种子接种至各不同培养基上1周后开始膨大，颜色由灰白转绿。2周后可见叶芽从膨大的种胚一端顶出，添加高浓度激素的培养基上叶芽粗壮。3周后，叶芽变绿。数周后叶片展开。添加椰汁的培养基上叶芽生长缓慢，种胚持续膨大形成原球茎。培养50 d，原球茎诱导率分别达87.3%、92.3%，未见叶片展开（图1）。培养60 d，添加激素的培养基中白芨幼苗茎基粗壮，叶片向上展开，未见生根。1/2 MS培养基上白芨叶片自基部展开，叶片向四周展开，叶尖微垂，少数植株生根。暗培养的白芨种子萌发率低，种胚膨大后不形成原球茎，直接萌发为细弱的幼苗;幼苗移至光下后，生长十分缓慢。

2.2 基本培养基、生物添加剂及光周期对白芨种子萌发的影响

由表1可见，培养40 d，除暗培养处理外，各培养基上白芨种子发芽率均可达到90%以上。与1/2 MS相比，添加 1.0 mg/L NAA能明显提高白芨种子发芽率并促进幼苗生长。以1/2 MS为基本培养基时，白芨种子发芽势高，生活力更旺盛。以MS为基本培养基有利于提高白芨幼苗株高，促进其生长。马铃薯提取液对白芨萌发促进作用较小，甚至抑制了幼苗的生长。

2.3 激素对白芨种子无菌萌发的影响

不同浓度激素处理对白芨种子萌发有显著影响。添加1.0 mg/L NAA、1.6 mg/L 6-BA的培养基上，白芨种子发芽势较高（94.4%），幼苗株高达1.190 cm;添加0.2 mg/L NAA及1.2 mg/L 6-BA的培养基上，白芨种子发芽势最低（186%），幼苗较矮（0.104 cm）（表2、表3）。

表1 不同处理对白芨种子萌发的影响

培养基

发芽率（%）

20 d 30 d 40 d

株高

（cm）

1/2 MS+1.0 mg/L NAA 88.2±1.924ab 95.4±1.673a 97.0±2.449a 0.348±0.015b

MS+1.0 mg/L NAA 78.4±2.074c 96.6±3.209a 97.6±1.140a 0.398±0.016a

1/2 MS+马铃薯提取液 65.0±1.581d 83.4±2.510b 91.4±1.140b 0.252±0.036c

1/2 MS+20%椰汁 86.6±2.702b 96.8±1.304a 97.6±1.517a 0.206±0.021dendprint

1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁 89.8±1.304a 95.6±1.517a 96.2±2.168a 0.352±0.041b

1/2 MS暗培养 27.4±1.817f 45.8±1.095d 46.4±3.435c 0.112±0.013e

1/2 MS 60.8±1.924e 79.4±3.715c 90.2±0.837b 0.368±0.036ab

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

表2 不同激素对白芨种子发芽势的影响

6-BA浓度

（mg/L）

发芽势（%）

NAA浓度0.2 mg/L NAA浓度0.4 mg/L NAA浓度0.6 mg/L NAA浓度0.8 mg/L NAA浓度1.0 mg/L

0.4 44.2±4.970k 60.2±3.421i 42.0±3.606k 81.2±6.496cd 87.2±3.563b

0.8 35.2±4.764l 42.2±3.271k 53.0±4.301j 71.2±4.970fg 82.0±2.828cd

1.2 18.6±1.517n 24.6±2.302m 31.2±1.483l 44.4±2.074k 59.6±2.966i

1.6 74.6±2.702f 79.8±2.774de 84.6±3.782bc 89.0±2.915b 94.4±1.673a

2.0 64.8±2.280h 69.8±2.775g 75.6±2.966ef 73.0±3.240fg 79.6±5.030de

注：所有数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

表3 不同激素对白芨幼苗株高的影响

6-BA浓度

（mg/L）

株高（cm）

NAA浓度0.2 mg/L NAA浓度0.4 mg/L NAA浓度0.6 mg/L NAA浓度0.8 mg/L NAA浓度1.0 mg/L

0.4 0.094±0.038j 0.232±0.029ghi 0.386±0.058f 0.436±0.047f 1.050±0.156b

0.8 0.296±0.028g 0.312±0.038g 0.392±0.071f 0.448±0.048f 0.812±0.061d

1.2 0.104±0.011j 0.198±0.037i 0.292±0.026gh 0.712±0.037e 0.874±0.113d

1.6 0.212±0.026hi 0.242±0.038ghi 0.272±0.029ghi 0.970±0.051c 1.190±0.042a

2.0 0.242±0.018ghi 0.402±0.026f 0.806±0.111d 0.834±0.043d 1.000±0.066bc

注：所有数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2.4 不同激素对白芨萌发影响的多重比较

由表4可知，白芨种子发芽势、幼苗株高在一定范围内随着6-BA、NAA浓度的增大而升高。6-BA浓度达1.6 mg/L时，白芨种子发芽势最大。与添加NAA的培养基相比，添加6-BA白芨种子发芽势极差较高，但幼苗株高极差偏低，表明NAA对白芨种子发芽势影响较6-BA小，但对幼苗生长促进作用较强。

3 结论与讨论

兰科植物种子细小，成熟时种皮细胞质、细胞器退化消失，成为死细胞[6]。胚发育不完全，缺乏供给营养成分的胚乳，自然条件下难以萌发。白芨为陆生兰类，陆生兰为适应其生长环境，其种子具有厚种皮及含有抑制萌发的物质性质[7]，其种子发芽较气生兰更困难。无菌培养白芨种子，必须提供其萌发所需的各种物质，椰汁、马铃薯提取液等生物添加剂能提高发芽率、发芽速度[6]，这与本研究结果基本相符。本试验发现，椰汁能诱导白芨种子直接形成原球茎，旦抑制幼苗生

表4 6-BA、NAA浓度对白芨萌发的影响

激素 浓度（mg/L） 发芽势（%） 株高（cm）

6-BA 0.4 62.96±19.379c 0.435±0.347b

0.8 56.72±18.281d 0.452±0.198b

1.2 35.68±15.146e 0.436±0.312b

1.6 84.48±7.512a 0.577±0.427a

2.0 72.56±6.001b 0.657±0.297a

极差 48.80百分点 0.222

NAA 0.2 47.48±20.821d 0.185±0.089e

0.4 55.32±20.326c 0.277±0.080d

0.6 57.28±20.713c 0.430±0.207c

0.8 71.76±15.870b 0.680±0.219b

1.0 80.56±12.282a 0.985±0.162a

极差 33.08百分点 0.800

注：同一激素处理同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

长，这可能与椰汁含有的激素种类和浓度有关。生长素、细胞分裂素在种子萌发过程中起着重要作用，尤以后者作用更为明显[8]。本研究发现，6-BA对白芨种子发芽的促进作用较NAA更为明显，这与前人研究相符。MS是成分比较完全的

培养基，1/2 MS虽与之成分相同，但大量元素减半。本研究结果表明，1/2 MS作为种子萌发培养基可以提高其发芽势，猜测高浓度盐离子影响细胞渗透势导致发芽势降低。发芽后应尽快将幼苗转接至MS培养基上壮苗，添加激素辅助其幼苗继续生长。光是影响种子萌发的重要因素之一，本研究发现，白芨种子萌发初期需光，暗培养的白芨种子萌发率低，转至光下萌发率未见显著增长，但可在无激素培养基上维持幼苗期长达数月，直至添加激素打破其生长停滞。这一发现对保存白芨种质及人工调控温室白芨苗生长期具有重大意义。综上所述，在12 h/12 h光周期下，考虑以1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA为萌发培养基较为适宜;以1/2MS+20%椰汁为培养基获得白芨原球茎。白芨种子萌芽初期细小，不宜转接，因此对于种子萌发培养基不仅要评价其提高种子活力的能力，而且要考虑其促进幼苗生长的作用。

参考文献：

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