四川省川南地区结核分枝杆菌Spoligotyping分型研究

邓建平,刘海灿,王 斌,董海燕,张正东,赵秀芹,李 群,万康林

四川省川南地区结核分枝杆菌Spoligotyping分型研究

邓建平1,刘海灿2,王 斌1,董海燕2,张正东1,赵秀芹2,李 群1,万康林2

目的 了解四川省川南地区结核分枝杆菌基因型构成情况，为结核病防控提供分子流行病学依据。方法 采用间隔区寡核苷酸分型(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)方法对四川省川南地区267株临床分离菌株进行基因分型，结果采用BioNumerics(Version 5.10)软件进行分析，并将Spoligotyping分型结果与SpolDB4.0数据库中的菌株进行比对分析。结果 267株结核分枝杆菌表现出66种基因型，其中51株表现为独特基因型，其余216株可聚为10个基因簇。与SpolDB4数据库比对分析发现，267株结核分枝杆菌中，144株为北京家族菌株(53.93%)，79株为T家族菌株(29.59%)，9株为H家族菌株，3株为U家族菌株，2株为MANU家族菌株，其余30株表现的基因型为数据库中不存在的基因型。结论 四川省川南地区结核分枝杆菌存在较高的基因多态性，北京家族菌株和T家族菌株为主要的流行菌株，应加强对这两类菌株的流行趋势的监测及生物学特性研究。

结核分枝杆菌；间隔区寡核苷酸分型；北京家族

基因分型技术是结核分枝杆菌分子流行病学研究中的重要方法，在追踪结核病的暴发流行、预测结核病的传播模式，以及研究结核分枝杆菌菌株之间的遗传学关系等方面具有重要的作用。Kamerbeek等提供的分析结核分枝杆菌DR区的寡核苷酸序列的分型方法(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)，是一种以PCR为基础的快速分型方法[1-2]，该方法简便，快速，能够同时对结核分枝杆菌进行检测和分型，并且数字化的实验结果能够方便的在不同实验室间进行结果比较，是目前应用最广泛的结核分枝杆菌基因分型方法。

本研究对在四川省川南地区收集的267株结核分枝杆菌临床菌株进行了Spoligotyping分型研究，以初步了解该地区结核分枝杆菌的基因型构成以及主要流行菌株的流行程度，为该地区结核病的防治工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 本研究中的267株结核分枝杆菌临床分离菌株，由四川省自贡市疾病预防控制中心结核病防治所提供。结核分枝杆菌实验室标准菌株H37Rv和BCG购自中国食品药品检定研究院，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传代培养。

1.2 主要试剂与仪器 2×Taq MasterMix( 北京康为世纪生物科技有限公司)、Biodyne C膜(Pall Biosupport公司)、streptavidin-peroxidase conjugate和CDP-star检测液(Amersham公司)。杂交仪(MN45，Immunetics公司)、生物安全柜、PCR仪、杂交炉等仪器由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

1.3 基因组DNA制备 取一菌环L-J培养基上生长良好的菌落，重悬于含有300 μL TE溶液的螺口管中，放入沸水浴中15 min，再12 000 r/min离心3 min；取上清液即为后续PCR过程使用的模板DNA，放-20 ℃保存备用。

1.4 Spoligotyping 参照Kamerbeek等研究中推荐使用的Spoligotyping 基因分型标准操作方法，对本研究中收集的267株结核分枝杆菌临床菌株进行分型操作[2]。实验过程中以H37Rv和BCG的基因组DNA作为阳性对照物，蒸馏水作为阴性对照物。

1.5 数据分析 将实验结果转换为数字化结果并录入Excel表，其中杂交结果阳性用“1”表示，阴性用“0”表示[3]。并将所有菌株的Spoligotyping 结果与SpolDB4.0数据库[4]进行比对分析确定菌株的Spoligotyping类型，再采用BioNumerics(Version 5.10)软件依据Spoligotyping结果用UPGMA方法对菌株进行聚类分析[5]。

2 结 果

2.1 菌株多态性分析 根据Spoligotyping分型结果，本研究收集的267株结核分枝杆菌临床分离菌株表现出66种Spoligotyping基因型(图1)， 其中51株结核菌株表现为独特的Spoligotyping基因型，其余的216株结核菌株可聚为10个基因簇(2～128株/簇)，菌株成簇率为77.15%。

从左至右为(1)UPGMA聚类树，(2) Spoligotyping 指纹图谱(3)对应基因型的菌株数量

From left to right: 1) UPGMA dendrogram generated by Spoligotyping patterns. 2) Spoligotyping patterns. 3) Strains numbers.

图1 267株结核分枝杆菌Spoligotyping分型结果聚类图

Fig.1 Spoligotypes of the 267M.tuberculosisstrains.

2.2 Spoligotpying分型结果 将本研究中的267株结核分枝杆菌的Spoligotyping分型结果与SpolDB4.0数据库中的数据进行比对分析后发现，共有144株结核分枝杆菌临床分离菌株被鉴定为北京家族(Spoligotyping分型结果中1～34间隔区缺失，35～43九个间隔区中有3个或3个以上间隔区存在)，占全部菌株的53.93%。另外，有79株被鉴定为T家族，9株为H家族，3株为U家族，2株为MANU家族，其余30株结核菌株的Spoligotyping基因型在比对数据库中不存在，为本研究中特异性的Spoligotyping分型结果。

3 讨 论

结核分枝杆菌Spoligotyping分型方法是目前应用最广泛的分子分型方法之一[6-7]，并且国际上已经建立了基于Spoligotyping的基因分型数据库(SpolDB4.0)[4]。目前，该数据库共包含了来自全球141个国家和地区的39 295株结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)菌株的Spoligotyping分型数据，可以通过将某地区获得的Spoligotyping分型结果与该数据库中的数据比对分析，进行样品菌株的分型鉴定工作；同时，也可以提示地区局部的菌株流行特征。既往的结核分枝杆菌的分子流行病学研究结果显示，目前全球范围内的结核病流行，主要是由几种特殊的结核分枝杆菌基因家族菌株引起的，如北京家族，T家族，H家族，CAS家族，EAI家族以及其它局部地区流行的菌株家族等。不同的基因家族菌株，具有不同的分子特征、地区性分布以及致病性，甚至在药物敏感性方面也具有较大差异[8-10]。北京家族菌株在不同的研究报告中被发现分布广泛，并被认为可能具有更强的致病能力，约占全世界临床分离菌株的13%，在亚洲远东地区更是高达50%左右[4, 11]。我国部分省、市、自治区对结核分枝杆菌北京家族基因型也进行了深入的研究，发现结核分枝杆菌北京家族菌株为我国主要流行的菌株，且总体上北方省份北京家族菌株所占的比例要高于南方省份，特别是在黄河以北部分省区分离菌株中的最高占比更是可达80%以上[12-17]。另外，既往研究发现结核分枝杆菌北京家族基因可能具有更强的传播能力和毒力，并可能与耐药性结核病存在关联[18]。因此研究不同地区主要流行的结核分枝杆菌的基因型构成，特别是北京基因型菌株的流行状况，对当地结核病的分子流行病学监测和结核病防治工作都具有重要的意义。

本研究对从四川省川南地区分离收集的267株结核分枝杆菌进行了Spoligotyping基因分型研究。通过研究发现在267株结核分枝杆菌中，北京家族菌株占全部菌株的53.93%，与既往研究结果一致，即北京家族菌株仍为该地区的主要流行菌株，但却显著低于相邻的西藏地区(约90%)，这可能与两地人口构成差异等有关。结核分枝杆菌T家族菌株在本地区是流行程度仅次于北京家族菌株的一类菌株，既往的研究发现结核分枝杆菌T家族菌株为欧美的主要流行菌株，但近年在我国其它地区进行的研究中也发现了T家族菌株的流行，此家族菌株流行的具体原因仍然需要更深入的研究。此外本研究中还发现H家族、U家族和MANU家族菌株，及其它未在SpolDB4.0数据库中收录Spoligotyping类型的菌株，可以发现本次研究中的菌株表现出一定的多态性。但是，由于Spoligotyping分型数据不能对北京家族菌株之间进行有效的区分，需要引入更精确的分型方法进行研究，以便进行病例追踪、复发调查等研究工作。

总之，本研究对四川省川南地区结核分枝杆菌的基因型构成及主要流行菌株的流行情况进行了初步描述，发现北京家族菌株和T家族菌株为川南地区的主要流行菌株，在结核病的分子流行病学监测中应当加强对这两类基因家族菌株的监测，对四川省川南地区结核病的流行趋势分析具有重要意义。

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Spoligotyping ofMycobacteriumtuberculosisin the South of Sichuan Province

DENG Jian-ping1,LIU Hai-can2,WANG Bin1,DONG Hai-yan2,ZHANG Zheng-dong1,ZHAO Xiu-qin2,LI Qun1,WAN Kang-lin2

(1.ZigongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zigong643000,China; 2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesPreventionandControl,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the distribution of genotypes ofMycobacterium(M.)tuberculosisin the South of Sichuan Province. And furtherly, to provide the basis on molecular epidemiology for tuberculosis (TB) prevention and control. In the year of 2010, 267 clinical isolates were genotyped by using spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping) in the South of Sichuan. After that, BioNumerics (Version 5.10) software was used to analysis the results and then compared them to the SpolDB4 database. Of the 267M.tuberculosisisolates, there were 66 genotypes. Of which 51 strains showed unique genotypes, and the remaining 216 strains were grouped into 10 gene clusters. By comparing with the SpolDB4.0 database,we found that 144 strains belonged to the Beijing family (53.93%), 79 strains were the T family (29.59%), nine H-family strains, three U-family strains, two MANU-family strains, the other 30 strains showed strange genotype that didn't exist in the SpolDB4.0 database. In the South of Sichuan,M.tuberculosishas high gene polymorphism, Beijing family and T family strains are the main epidemic strains. It’s necessary to strengthen the monitoring and biological characteristics research of the two genotypes strains.

Mycobacteriumtuberculosis; Spoligotyping; Beijing family

Wan Kang-lin,Email:wankanglin@icdc.cn; Li Qun, Email:lqzgcdc@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.006

万康林，Email:wankanglin@icdc.cn; 李群，Email:lqzgcdc@163.com

1．四川省自贡市疾病预防控制中心，自贡 643000； 2.传染病预防控制国家重点实验室，感染性疾病诊治协同创新中心，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1116-04

2015-07-30；

2015-11-17

“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”国家科技重大专项“十二五”课题(No.2013ZX10003006-002)。(邓建平和刘海灿为同等贡献)

Supported by the project of Chinese National Key Program of Mega Infectious Disease(No.2013ZX10003006-002)(Deng Jian-ping and Liu Hai-can contributed equally to this work).