西安市非结核分枝杆菌感染现状调查分析

周爱萍，贺拥军，孙亚楠，张增贤

西安市非结核分枝杆菌感染现状调查分析

周爱萍1，贺拥军1，孙亚楠1，张增贤2

目的 了解西安市结核病患者中非结核分枝杆菌感染情况。方法 收集西安市胸科医院检验科分离培养的分枝杆菌临床菌株，利用两步PCR方法及PCR产物直接测序的方法进行菌种鉴定。结果 经鉴定发现，收集的202株分枝杆菌中有195株为结核分枝杆菌，3株为牛结核分枝杆菌，2份为鸟分枝杆菌，1份为堪萨斯分枝杆菌，1份为灰色链霉菌，非结核分枝杆菌感染率为1.5%(3/201)。结论 西安市尚存在一定比例非结核分枝杆菌感染，进一步菌种鉴定有利于临床正确诊断和合理用药治疗。

结核分枝杆菌；非结核分枝杆菌；菌种鉴定

结核病发病率目前在全球范围内一直居高不下，2014年WHO发布的全球结核病报告中，中国是全球22个结核病高负担国家之一，居世界第2位。结核病主要是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)感染引起的，而非结核分枝杆菌(Nontuberculousmycobacteria，NTM)感染人体后引起的NTM肺病与结核病的临床表现较难区别。近年来非结核分枝杆菌疫情呈现上升趋势。由于MTBC与NTM对不同抗菌药物敏感性不同，其治疗方案存在很大差别，故二者的鉴别具有重要的临床意义[1]。

本研究利用两步法PCR技术和PCR产物直接测序的方法对来自西安市结核病院的202株临床分离培养的分枝杆菌进行菌种鉴定，以了解西安市结核病人中非结核分枝杆菌的感染比例，为结核病的临床治疗及预防控制工作提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集西安市结核病医院2007年10月至2008年12月间通过BACTAC MGIT 960分枝杆菌快速培养系统培养的菌株202株。结核分枝杆菌标准株H37Rv、卡介苗(BCG)及不动杆菌基因组DNA为本实验室保存。2×Taq PCR MasterMix、Taq酶、50 bp ladder DNA Mark购于北京天根生化科技有限公司；三磷酸脱氧核苷(dNTP)购于Sigma公司；100 bp DNA ladder Plus购于MBI Fermentas 公司；PCR产物纯化试剂盒购于Omega公司；引物合成于上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 分枝杆菌基因组DNA的提取 参考沈国妙等的方法[2]，用水煮法提取结核分枝杆菌基因组DNA。PCR扩增时一般取1 μL作为模板。

1.2.2 结核分枝杆菌菌种鉴定 根据文献[3]合成结核分枝杆菌菌种特异性引物(MISP1/MISP2)，引物序列及产物大小见表1。以BCG基因组DNA为阴性对照，H37Rv基因组DNA为阳性对照进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 45 s→64 ℃ 45 s→72 ℃ 30 s共35个循环；最后72 ℃ 延伸7 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。并取5份PCR阳性产物，送上海美季生物技术有限公司进行序列测定，并将测序结果与GenBank进行比对。

1.2.3 结核分枝杆菌复合群鉴定 根据文献[4]合成结核分枝杆菌复合群特异性引物(MTC-F/MTC-R)，引物序列及产物大小见表1。H37Rv基因组DNA为阳性对照进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 45 s→68 ℃ 45 s→72 ℃ 1 min，共30个循环；最后72 ℃ 延伸7 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.4 分枝杆菌菌种鉴定 根据文献[5]合成分枝杆菌菌种鉴定引物(Hsp65-F/Hsp65-R)，扩增hsp65基因高变区，引物序列及产物大小见表1。以H37Rv基因组DNA为阳性对照，不动杆菌基因组DNA为阴性对照，同时选2份经结核分枝杆菌菌种鉴定为阳性的菌株扩增。PCR条件为：95 ℃ 5 min；然后95 ℃ 45 s→62 ℃ 45 s→72 ℃ 30 s共35个循环；最后72 ℃ 延伸7 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR产物送上海美季生物技术有限公司进行序列测定，并将测序结果与GenBank进行比对。

表1 结核分枝杆菌菌种鉴定用引物

2 结 果

2.1 结核分枝杆菌菌种鉴定 用结核分枝杆菌菌种特异性引物对202份临床菌株DNA样本进行PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。部分样品的PCR产物电泳结果见图1。Marker为Fermentas 公司100 bp核酸ladder。可见阳性对照H37Rv在172 bp处出现特异性扩增条带，阴性对照BCG无扩增条带。经鉴定202份样本中有195份样本为结核分枝杆菌，另7份不是结核分枝杆菌。随机选取5份样本PCR产物进行测序，所得的基因序列经NCBI网站所提供的Blast比对功能进行比对，结果均为结核分枝杆菌。

图1 结核分枝杆菌菌种鉴定的结果

2.2 结核分枝杆菌复合群鉴定 对7份上述PCR扩增阴性的样本，进行结核分枝杆菌复合群特异性引物PCR扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物电泳结果见图2。阳性对照H37Rv在245 bp处出现特异性条带， 3株菌(159、96和112)有相应大小产物生成，为结核分枝杆菌复合群菌株，4株没有扩增条带。

图2 结核分枝杆菌复合群鉴定结果

2. 3 分枝杆菌菌种鉴定 对7份已鉴定不是结核分枝杆菌的菌株，扩增hsp65基因高变区并直接测序。序列提交NCBI数据库进行Blast，结果有3株牛结核分枝杆菌，2株鸟分枝杆菌，1株堪萨斯分枝杆菌、1株灰色链霉菌。

3 讨 论

NTM是指分枝杆菌属中除了MTBC(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。NTM作为一种环境微生物通常对人类没有致病作用。但20世纪80年代以来，随着艾滋病感染者人数的增多，播放型NTM[6-7]感染报道不断增加。中国NTM感染也呈现不断上升趋势。1990年有报道我国NTM感染率为15.4%，2000年全国第4次结核病流行病学调查表明，NTM占分离菌株的11.1%[8]，2010年全国第5次结核病学调查，以传统生化方法(对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)生长试验法)在363株分离培养菌株中鉴定到83株NTM(22.9%)[9]。上海市肺科医院报道，1998-2004年上海市NTM感染率也呈现出逐年上升趋势[10]。由于NTM病的临床症状与结核病十分相似，而大多NTM对抗结核药物具有一定的耐受性，因此分枝杆菌菌种的鉴定对临床针对性用药而言，显得十分重要。

传统的分枝杆菌鉴定方法主要是PNB、TCH改良罗氏培养法，对NTM鉴定的准确率低[11]。核酸扩增的方法能够快速、准确地对分枝杆菌进行鉴定，因此得到了广泛的应用。本研究根据参考文献[3]首先扩增结核分枝杆菌rv1508c基因中MTB种特异性序列，发现202株临床分离株中有7株不是结核分枝杆菌，而后扩增IS6110中MTBC特异性序列发现7株菌中有3株扩增阳性，4株为阴性。为进一步确认PCR鉴定结果的准确性，本研究对编码分枝杆菌主要免疫反应蛋白之一的hsp65基因特定核酸序列进行扩增并测序，结果发现7份样本中有3株牛结核分枝杆菌、2株鸟分枝杆菌、1株堪萨斯分枝杆菌、1株灰色链霉菌。灰色链霉菌是链霉素的产生菌，为土壤习居菌，是机会致病菌。在长期使用广谱抗生素及机体免疫力低下的患者中能够引起脓肿及败血症等。在本研究中考虑到患者的主要临床表现及灰色链霉菌致病性及耐药性，我们认为可能是分枝杆菌在进行分离培养时的污染菌株。因此，西安市201株临床分离分枝杆菌中，198株为MTBC(包括195株结核分枝杆菌和3株牛分枝杆菌)，另有3株为NTM，其感染率为1.5%(3/201)。该结果与上海市肺科医院报道的上海市NTM感染率(平均2.29%)及2012年新英格兰杂志上报道的中国NTM感染率(3.4%)[12]有一定可比性，远远低于2010年全国结核病流行病学调查结果(22.9%)。

西安市结核病患者中存在一定比例的NTM感染，并且NTM大多对抗结核药物有相当的耐受性，因此对于临床难治的病例应该进行必要的菌种鉴定和药物敏感试验，为临床用药提供参考。

[1]He GJ, Xiao HP. Progress in the non-tuberculous mycobacteria diseases[J]. Anti-infect Pharm, 2005, 2(2): 60-63. DOI: 10.3969/j.issn.1672-7878.2005.02.003 (in Chinese) 何国钧,肖和平.非结核分枝杆菌病的治疗研究进展[J].抗感染药学,2005,2(2): 60-63.DOI: 10.3969/j.issn.1672-7878.2005.02.003

[2]Shen GM, Xue Z, Shen X, et al. Study on the cause of tuberculosis recurrence byMycobacteriumtuberculosisgenotyping method[J]. Chin J Tuberculosis Respir Dis, 2006, 29(2): 79-82. DOI: 10.3760/j.issn.1001-0939.2006.02.003 (in Chinese) 沈国妙,薛桢,沈鑫,等.利用结核分枝杆菌基因型分型技术研究外源性再感染在结核病复发中的作用[J].中华结核和呼吸杂志, 2006, 29(2): 79-82.DOI: 10.3760/j.issn.1001-0939.2006.02.003

[3]Qin L, Zheng R, Fan C, et al. Identification and evaluation of a new nucleic acid amplification test target for specific detection ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Clin Chem Lab Med, 2010, 48(10): 1501-1505. DOI: 10.1515/CCLM.2010.296

[4]De Wit D, Steyn L, Shoemaker S, et al. Direct detection ofMycobacteriumtuberculosisin clinical specimens by DNA amplification[J]. J Clin Microbiol, 1990, 28(11): 2437-2441. DOI:10.1183/09031936.98.11061215

[5]Telenti A, Marchesi F, Balz M, et al. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis[J]. J Clin Microbiol, 1993, 31(2): 175-178.

[6]Jones D, Havlir V. Nontuberculous mycobacteria in the HIV infected patient[J]. Clin Chest Med, 2002, 23(3): 665-674. DOI: 10.1016/S0272-5231(02)00015-1

[7]Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott BA, et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2007, 175(4): 367-416. DOI: 10.1164/rccm.200604-571ST

[8]National Technical Steering Group of the Epidemiological Sampling Survey for Tuberculosis Office. Report on nationwide random survey for the epidemiology of tuberculosis in 2000[J]. Chin J Nosocomiol, 2002, 24(2): 65-71. DOI: 10.3969/j.issn.1000-6621.2002.02.001 (in Chinese) 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志,2002,24(2):65-71.

[9]Wang LX, Cheng SM, Chen MT, et al. The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010[J]. Chin J Antituberculosis, 2012, 34(8): 485-508. (in Chinese) 王黎霞,成诗明,陈明亭,等.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志, 2012, 34(8): 485-508.

[10]Liang L, Zhang YR, Yue J, et al. Susceptibility pattern and epidemiology of nontuberculous mycobacteria in Shanghai[J]. Chin J Nosocomiol, 2007, 17(7): 895-897. DOI: 10.3321/j.issn:1005-4529.2007.07.054 (in Chinese) 梁莉, 张滢蓉, 乐军, 等. 上海市非结核分枝杆菌感染趋势及耐药分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2007, 17(7): 895-897.

[11]Aminaguli T, Hu X, Wang J, et al. Comparison of traditional method and PCR method in the identification ofM.tuberculosiscomplex[J]. Chin J Antituberculosis, 2013, 35(2): 103-107. (in Chinese) 阿米娜古丽·塔西铁木尔,胡昕,王晶.等.传统方法和PCR法在结核分枝杆菌复合群菌种鉴定中的对比研究[J].中国防痨杂志, 2013, 35(2): 103-107.

[12]Zhao Y, Xu S, Wang L, et al. National survey of drug-resistant tuberculosis in China[J]. N Engl J Med, 2012, 366(23): 2161-2170. DOI: 10.1056/NEJMoa1108789

Epidemiology of nontuberculous mycobacteria in Xi’an, China

ZHOU Ai-ping1,HE Yong-jun1,SUN Ya-nan1,ZHANG Zeng-xian2

(1.SchoolofMedicine,TibetUniversityforNationalities,Xianyang712082, China; 2.ClinicalLaboratory,Xi'anChestHospital,Xi'an710061, China)

Nontuberculous mycobacteria (NTM) are all the other mycobacteria which do not cause tuberculosis or leprosy. Recently, NTM disease presents a rising tendency in the world. The most common clinical manifestation of NTM disease is lung disease. The clinical symptoms of pulmonary NTM disease are similar to pulmonary TB but most of the NTM are resistant to anti-TB drugs. In order to examine the prevalence of NTM in Xi'an, two-step PCR and PCR-sequencing were used to identify the NTM strains from all the mycobacterial clinical isolates in this study. Of all the 202 clinical isolates, 195 wereM.tuberculosis, 3 wereM.bovis, 2 wereM.avium, 1 wasM.kansasii, 1 wasStreptomycesgriseus, and the prevalence rate was 1.5% (3/201). Our research showed that there was a certain proportion of NTM disease in Xi'an. The result indicates that strain identification is necessary for clinical resistant cases and can provide reference for clinical treatment.

Mycobacteriumtuberculosis; nontuberculosis; species identification

Zhou Ai-ping, Email: abby_aiping@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.023

国家自然科学基金(No. 31200109)；西藏民族学院校内项目青年学人培育计划(No. 15MYQP06)和西藏自治区科技计划项目(No. Z2012A33G20100)联合资助

周爱萍，Email：abby_aiping@126.com

1.西藏民族大学医学院高原环境与疾病相关基因研究高校重点实验室，咸阳 712082； 2. 西安市胸科医院检验科，西安 710061

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1196-04

2015-05-18；

2015-09-14

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31200109), the Young Scholars Training Program of Tibet University for Nationalities (No. 15MYQP06), and the Science and Technology Planning Project of Tibet Autonomous Region (No. Z2012A33G20100)