贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

汪鹏程，熊小路，焦 俊，龚文平，杨小梅，温博海

贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

汪鹏程1,2，熊小路1，焦 俊1，龚文平1，杨小梅1，温博海1

目的 使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法 本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性；11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外，其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应，除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外，其它血清反应均为阴性。另外，Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%，GroEL为25.0%，Mip为25.0%，OmpH为25.0%，RplL为13.9%。结论 这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性，可用作Q热血清学诊断。

贝氏柯克斯体；Q热； 表面蛋白；酶联免疫吸附试验

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31170161) and the National Science and Technology Major Project of China (No. 2013ZX10004803). Corresponding authors: Xiong Xiao-lu, Email:xiongxlu624@sohu.com; Wen Bo-hai, Email:bohaiwen@sohu.com

Q热(Q fever)是由贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)引起的一种重要的人兽共患病，为全球性广泛分布[1]。人群Q热暴发流行常常源于羊群的贝氏柯克斯体暴发感染，因此“Q热”又俗称“羊流感”。贝氏柯克斯体易感染家畜，主要是羊、牛，导致孕畜流产，给畜牧业造成严重经济损失；而贝氏柯克斯体感染的家畜又是人Q热的主要传染源，可引起人群Q热的暴发和流行。2007年荷兰大范围暴发由贝氏柯克斯体感染羊所致的“羊流感”，造成数千人感染和多人死亡,引起了国际社会强烈关注[2]。流行病学调查显示Q热疫区遍布世界各国，在我国的分布十分广泛,目前至少有20多个省市自治区报道过Q热病例,其中四川、云南、内蒙、新疆和西藏等地还发生过Q热的流行[3]。Q热早期主要表现为发热、疲乏等，无特异性的临床症状，容易误诊为一般的流感。因此，早期确诊对于Q热患者的有效治疗与Q热流行的控制十分重要。

人Q热诊断主要依赖血清学诊断，常用方法为间接免疫荧光试验(IFA)。由于贝氏柯克斯体为感染性很强的呼吸道传播病原菌，需要在高等级生物安全实验室培养，因此难以在普通实验室制备大量IFA抗原片供Q热血清学诊断，另外由于IFA操作较为复杂、难以标准化等限制IFA血清学诊断Q热在临床实验室推广应用。目前，国际上已采用贝氏柯克斯体抗原进行酶联免疫吸附分析(ELISA)代替IFA作为Q热实验室诊断的方法。

本实验室采用免疫蛋白质组学[4]和表面蛋白质组学[5]等方法，鉴定出Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL等为贝氏柯克斯体主要菌体表面蛋白，并证明其为主要血清免疫源性蛋白，可以作为Q热血清学诊断候选抗原，因此，本实验室已克隆表达5种主要表面蛋白抗原，制备Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组蛋白。本研究用这5种重组蛋白作为抗原建立ELISA方法,检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清以及Q热患者血清对重组蛋白的反应性，并同时检测其它立克次体感染小鼠血清和患者血清，以初步评价这5种重组蛋白为抗原的ELISA的特异性和敏感性，为其进一步的临床应用提供必要的依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 Ni-NTA纯化试剂盒为德国QIAGEN产品；低分子量蛋白Marker等为中科瑞泰(北京)生物科技有限公司产品；FITC、HRP标记羊抗小鼠/人IgG为北京博奥森公司产品；96孔ELISA板购自美国康宁公司。ELISA包被液、封闭液、TMB反应底物、终止液均购自eBioscience公司。贝氏柯克斯体、黑龙江立克次体、莫氏立克次体、恙虫病东方体等IFA抗原片为本实验室制备。

1.2 立克次体菌株与实验感染小鼠血清 贝氏柯克斯体(新桥株)、莫氏立克次体(Wilmington株)、黑龙江立克次体(054株)、恙虫病东方体(Karp株)为军事医学科学院微生物流行病研究所立克次体学实验室保存。用以上立克次体分别腹腔接种6周龄BALB/c小鼠，感染4周后取血，分离血清-20 ℃冻存备用。血清用相应的立克次体抗原片间接免疫荧光检测，结果显示效价≥1∶200。

1.3 立克次体患者血清 Q热、斑点热、斑疹伤寒、恙虫病患者血清分别由安徽医科大学公共卫生学院柳燕教授、广州市第八人民医院、江苏省疾病预防控制中心惠赠。以上患者血清用相应的立克次体抗原片按常规方法使用间接免疫荧光检测，结果显示效价均≥1∶100。

1.4 贝氏柯克斯体重组蛋白制备 将本室制备的表达贝氏柯克斯体Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL的大肠埃希氏菌[4]分别接种含氨苄青霉素100 μg/mL的LB培养基，37 ℃培养2 h后加入终浓度为240 μg/mL的IPTG诱导表达4 h，然后对诱导表达菌做聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以鉴定其是否能够表达目的蛋白。将鉴定后的大肠埃希氏菌接种含氨苄青霉素的LB液体培养基，并用IPTG诱导大肠埃希氏菌表达目的蛋白，然后用Qiagen公司的Ni-NTA试剂盒从大肠埃希氏菌中亲和层析纯化目的蛋白。

1.5 重组蛋白与立克次体感染小鼠血清或患者血清做ELISA分析 用ELISA包被液稀释贝氏柯克斯体重组蛋白至3 μg/mL，再将其分别加到ELISA板(每孔100 μL)4 ℃包被过夜。包被结束后弃上清，加入PBST(含0.05%Tween的PBS)进行洗涤(每孔加入200 μL，摇振5 min)，拍干后每孔加入200 μL封闭液4 ℃过夜，PBST洗涤3次后待用。用大肠埃希氏菌裂解液(5 mg/mL)中和每份待检血清，然后用封闭液对其作1∶200稀释。将每份稀释血清加入到相应孔中，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤3次后每孔加入1∶4 000稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠或人IgG抗体(每孔100 μL)，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤3次后每孔加入100 μL TMB底物，10 min后加入100 μL终止液，立即于酶标仪上测定每孔OD450值。

1.6 统计学分析 各组血清与单个蛋白反应OD450值差异采用单因素K平方差分析及Student-Newman-Keuls分析，P值<0.05为差异有统计学意义。以上统计学分析均使用SAS 9.1软件完成。统计正常血清与每个蛋白反应OD450值，以正常小鼠血清或正常人血清与单个蛋白反应OD450平均值加3倍标准差为cut-off值来判断感染血清与该蛋白反应阳性及阴性结果。

2 结 果

2.1 贝氏柯克斯体重组蛋白的纯化 将表达贝氏柯克斯体Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL的大肠埃希氏菌分别接种含有氨苄青霉素LB液体培养基并使用IPTG诱导重组蛋白表达；采用Ni-NTA对表达的重组蛋白进行分离纯化，SDS-PAGE分析确认表达的重组蛋白分子量与预期大小一致(图1)。

图1 SDS-PAGE分析贝氏柯克斯体5种重组蛋白在大肠埃希氏菌表达

Fig.1 Expression of 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiiinE.colicells analyzed by SDS-PAGE

2.2 ELISA分析贝氏柯克斯体重组蛋白与感染小鼠血清反应 将贝氏柯克斯体、莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体感染小鼠血清以及正常小鼠血清各8份与5种贝氏柯克斯体蛋白进行ELISA反应，结果显示5种贝氏柯克斯体重组蛋白中除RplL与1份贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应为阴性外，其它蛋白与8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应均为阳性，每种蛋白与8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应的OD值均显著高于与其它立克次体感染小鼠血清反应的OD值(Com1:F=36.509,P<0.001; GroEL:F=67.436,P<0.001; Mip:F=631.337，P<0.001; OmpH:F=17.636,P<0.001; RplL:F=17.733,P<0.001)。其它立克次体感染小鼠血清与这5种贝氏柯克斯体蛋白反应，除GroEL与1份黑龙江立克次体感染血清反应为阳性外，其余均为阴性，见表1和图2。

2.3 ELISA分析贝氏柯克斯体重组蛋白与患者血清反应 将11份Q热、13份斑点热、12份恙虫病、11份斑疹伤寒患者血清、17份正常人血清与5种贝氏柯克斯体蛋白进行ELISA反应，结果显示5种贝氏柯克斯体重组蛋白至少与11份Q热患者血清反应阳性，每一种蛋白与Q热患者血清的平均OD值均显著高于与其它立克次体病患者血清的反应值(Com1:F=44.902,P<0.001; GroEL:F=26.263,P<0.001; Mip:F=30.445,P<0.001; OmpH:F=23.455，P<0.001; RplL:F=23.704,P<0.001)。其它立克次体感染患者血清与这5种贝氏柯克斯体蛋白的反应阳性数为0或1～4份，见表2，图3。

表1 立克次体感染小鼠血清与贝氏柯克斯体重组蛋白的ELISA反应OD450值及阳性数

Tab.1 Reaction intensities and positive rates of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

重组蛋白Recombinantprotein小鼠血清Serafrommiceinfectedwithdifferentrickettsiae贝氏柯克斯体莫氏立克次体黑龙江立克次体恙虫病东方体正常血清CoxiellaburnetiiRickettsiamooseriRickettsiaheilongjiangensisOrientiatsutsugamshiNormalseraCom10.885±0.319(8/8,100%)0.209±0.021(0/8,0%)0.204±0.021(0/8,0%)0.207±0.021(0/8,0%)0.162±0.036(0/8,0%)GroEL1.324±0.386(8/8,100%)0.191±0.020(0/8,0%)0.209±0.055(1/8,12.5%)0.189±0.027(0/8,0%)0.145±0.032(0/8,0%)Mip1.126±0.110(8/8,100%)0.191±0.017(0/8,0%)0.184±0.019(0/8,0%)0.177±0.026(0/8,0%)0.180±0.033(0/8,0%)OmpH0.881±0.483(8/8,100%)0.170±0.011(0/8,0%)0.161±0.015(0/8,0%)0.155±0.010(0/8,0%)0.163±0.032(0/8,0%)RplL0.657±0.334(7/8,87.5%)0.168±0.011(0/8,0%)0.164±0.011(0/8,0%)0.146±0.011(0/8,0%)0.140±0.046(0/8,0%)

3 讨 论

贝氏柯克斯体主要血清反应蛋白Com1是最早鉴定的贝氏柯克斯体外膜蛋白[6]，GroEL是一种热休克蛋白 (HspB)[7]，Mip是一种与毒力相关、存在菌体表面的肽基脯氨酸异构酶[8]，OmpH 是一种促进菌体内蛋白向菌体外释放的外膜伴侣蛋白[9]，RplL则是一种细菌核糖体蛋白(L12)。这些蛋白均可存在菌体表面，当贝氏柯克斯体感染时，诱导机体免疫应答，产生特异性抗体。因此，本研究使用Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组蛋白分别作为包被抗原进行ELISA，检测贝氏柯克斯体感染血清以及其他几种主要立克次体感染血清中抗体，分析这5种贝氏柯克斯体蛋白抗原在Q热血清学诊断中的特异性和敏感性。

图2 立克次体感染小鼠血清与贝氏柯克斯体重组蛋白的ELISA反应强度散点图

Fig.2 Reaction intensities of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

表2 立克次体感染患者血清与贝氏柯克斯体重组蛋白的ELISA反应OD450值及阳性率

Tab.2 Reaction intensities and positive rates of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

重组蛋白Recombinantprotein患者血清erafrompatientssufferedfromdifferentrickettsialdiseasesQ热斑疹伤寒斑点热恙虫病正常血清QfeverEndemictyphusSpottedfeverTsutsugamushiNormalseraCom10.901±0.241(11/11,100%)0.311±0.116(2/11,18.2%)0.327±0.142(3/13,23.1%)0.327±0.142(3/12,25%)0.186±0.058(0/17,0%)GroEL0.882±0.388(11/11,100%)0.310±0.081(3/11,27.3%)0.332±0.139(4/13,30.8%)0.295±0.118(2/12,16.7%)0.178±0.074(0/17,0%)Mip0.798±0.257(11/11,100%)0.329±0.093(2/11,18.2%)0.346±0.164(4/13,30.8%)0.346±0.102(3/12,25%)0.186±0.071(0/17,0%)OmpH0.739±0.280(10/11,90.9%)0.349±0.115(3/11,27.3%)0.343±0.160(4/13,30.8%)0.284±0.080(2/12,16.7%)0.183±0.069(0/17,0%)RplL0.544±0.156(10/11,90.9%)0.290±0.106(3/11,27.3%)0.292±0.117(2/13,15.4%)0.235±0.067(0/12,0%)0.163±0.065(0/17,0%)

检测结果显示8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL蛋白反应为阴性外其它均为阳性；11份Q热患者血清中除1份血清与RplL蛋白、1份血清与OmpH蛋白反应为阴性外，其它血清反应均为阳性。该结果证明这些蛋白做ELISA诊断抗原检测Q热特异性IgG抗体有很好的敏感性。将这5个重组蛋白与莫氏立克次体(地方性斑疹伤寒病原体)、黑龙江立克次体(远东斑点热病原体)、恙虫病东方体(恙虫病病原体)感染小鼠血清反应，除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外，其它血清反应均为阴性，证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性，可用作Q热血清学诊断。为进一步分析这5种重组蛋白在Q热血清学诊断中的特异性，将这5种重组蛋白分别作为抗原进行ELISA，检测11份斑疹伤寒患者血清、13份斑点热患者血清、12份恙虫病患者血清。结果显示Com1对这3种立克次体感染患者血清的阳性反应率平均为22.2%，GroEL为25.0%，Mip为25.0%，OmpH为25.0%，RplL为13.9%。提示热休克蛋白GroEL、肽基脯氨酸异构酶Mip、外膜蛋白OmpH为细菌的保守蛋白，其血清学交叉反应较明显。由于本研究所收集的患者血清绝大多数来自农村地区，Q热为农村常见病，因此这些贝氏柯克斯体IgG抗体阳性的斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者可能曾经患过Q热。因此，可使用这5种贝氏柯克斯体蛋白抗原进行ELISA，检查患者血清中的特异性IgM抗体可以排除这种血清交叉反应，提高ELISA血清学诊断的特异性。

图3 立克次体感染患者血清与贝氏柯克斯体重组蛋白的ELISA反应强度散点图

Fig.3 Reaction intensities of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

本研究首次将贝氏柯克斯体Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组蛋白分别作为ELISA包被抗原，检测贝氏柯克斯体、莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清和临床患者血清，检测结果证明它们均有识别贝氏柯克斯体感染血清的良好特异性和敏感性。Q热为我国农村地区常见传染病，使用这5种贝氏柯克斯体重组蛋白抗原建立的ELISA将为我国Q热血清学诊断提供新的有效方法。

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Specificity and sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay with five recombinant surface protein antigens ofCoxiellaburnetii

WANG Peng-cheng1,2,XIONG Xiao-lu1,JIAO Jun1,GONG Wen-ping1,YANG Xiao-mei1,WEN Bo-hai1

(1.StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,the105thHospitalofPLA,Hefei230031,China)

In order to evaluate the usefulness of recombinant proteins ofCoxiellaburnettias serodiagnostic markers for Q fever, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coated with each of five recombinant surface protein antigens (Com1, GroEL, Mip, OmpH, or RplL) ofCoxiellaburnetiiwas assessed for specificity and sensitivity in detection of specific IgG antibodies in sera from mice experimentally infected withC.burnetiiand patients suffered from Q fever. As a result, all of 8 sera fromC.burnetii-infected mice positively reacted with the five recombinant proteins, except for one serum which negatively reacted with RplL, while all of 8 sera from mice infected withRickettsiamooseri,Rickettsiaheilongjiangensis, orOrientiatsutsugamshinegatively reacted with the five proteins, except for one serum which positively reacted with GroEL. In addition, the average positive ratio of 11 sera from patients with endemic typhus, 13 sera from patients with spotted fever, and 12 sera from patients with tsutsugamushi disease were 22.2% for reaction to Com1, 25.0% for GroEL, 25.0% for Mip, 25.0% for OmpH, and 13.9% for RplL, respectively. Results suggest that the ELISA with Com1, GroEL, Mip, OmpH, or RplL has high specificity and sensitivity for serological diagnosis of Q fever.

Coxiellaburnetii; Q fever; surface protein; enzyme-linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.005

国家自然科学基金(No.31170161)和国家科技重大项目(No.2013ZX10004803)联合资助

熊小路，Email: xiongxlu624@sohu.com; 温博海，Email: bohaiwen@sohu.com

1.军事医学科学院微生物流行病研究所，病原生物生物安全国家重点实验室，北京 100071;

2.中国人民解放军第105医院检验科，合肥 230031

R446.5

A

1002-2694(2015)12-1111-05

2015-03-09；

2015-06-11