新疆维吾尔族急性缺血性脑卒中短期预后与5-脂氧合酶激活蛋白SG13S32位点及危险因素的相关性研究

刘 梦 殷立新 马建华 张小宁



新疆维吾尔族急性缺血性脑卒中短期预后与5-脂氧合酶激活蛋白SG13S32位点及危险因素的相关性研究

刘 梦 殷立新 马建华 张小宁

目的 探讨新疆维吾尔族人群急性缺血性脑卒中短期预后与5-脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase-activating，ALOX5AP)基因SG13S32位点、年龄、性别、就诊时间等危险因素的相关性。方法 选取194例新疆地区急性缺血性脑卒中经相同药物治疗后的维吾尔族患者,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测ALOX5AP基因SG13S32位点多态性，采用队列研究的统计分析方法比较不同基因型人群的短期预后改善情况,并经Logistic逐步回归分析，得出预后相关独立因素。结果 5-脂氧合酶激活蛋白基因SG13S32位点不同基因型间维吾尔族急性缺血性脑卒中短期预后改善差异无统计学意义(χ2=0.336，P=0.562)。经Logistic逐步回归分析，年龄、就诊时间及纤维蛋白原为影响维吾尔族急性缺血性脑卒中患者短期预后的独立因素。结论 5-脂氧合酶激活蛋白基因SG13S32位点不同基因型之间急性缺血性脑卒中短期预后改善没有明显差异，且不是影响维吾尔族急性缺血性脑卒中短期预后的独立危险因素。年龄、就诊时间及纤维蛋白原可影响急性缺血性脑卒中短期预后改善。

5-脂氧合酶激活蛋白基因 缺血性脑卒中 维吾尔族 短期预后

缺血性脑卒中是目前导致人类死亡的三大主要疾病之一[1,2]。引起急性缺血性脑卒中的病因，目前研究较多，分别指出年龄、性别、体重指数、家族史、血脂、血压、血糖等与其发生均有关[3～6]。另外还提出某些遗传基因也与其发生率有相关性，特别是2004年冰岛科学家发现5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)与缺血性脑卒中的发生具有相关性，可增加人群缺血性脑卒中的发生率[7，8]。

目前国内急性缺血性脑卒中治疗大部分遵循《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》。但仍发现在相同治疗下部分急性缺血性脑卒中患者的短期预后存在一定差异性。针对此情况，国内外对影响缺血性脑卒中预后因素进行相关研究，发现大部分病因与预后相关，为其独立危险因素[9～12]。但针对遗传基因与预后关系研究相对较少，故本研究选择新疆维吾尔族人群开展队列研究，主要了解在维吾尔族人群中该疾病的发展趋势和预后，探讨及评定5-脂氧合酶激活蛋白基因以及某些危险因素与急性缺血性脑卒中预后的相关性。帮助临床医师调整完善治疗决策，促进治疗水平的提高，并通过采取相应对策干预疾病向良性转归。

对象与方法

1.研究对象：选择新疆第一附属医院、阿克苏地区医院、和田地区医院神经内科2011年10月～2012年10月期间确诊为急性缺血性脑卒中的维吾尔族住院患者为研究对象。

2.纳入标准：(1)均符合1996年国际神经系关联病及卒中协会的缺血性脑卒中诊断标准，由神经内科专科医师经严格的神经系统查体，具有阳性体征；并结合头部CT和(或)MRI检查等确诊的首次急性缺血性脑卒中患者194例。(2)排除大动脉炎、外伤、血液病、药物、恶性肿瘤、血管畸形等引起的继发性缺血性脑卒中，且经头部CT检查，排除脑出血，排除无症状及体征的静止性脑梗死，排除短暂性脑缺血发作，排除既往有神经功能缺损、心房颤动、急性心肌梗死、冠心病、支气管哮喘病史的患者。(3)脑血管事件发生及就诊时间均在急性期内，均未给予溶栓治疗，且住院接受治疗天数≥2周。(4)入院后给予抗血小板聚集，降脂稳斑，改善脑循环及营养神经等药物，积极改善和恢复缺血区的血液供应，促进脑微循环，预防和治疗缺血性脑水肿，并给予相应并发症及危险因素对症治疗处理。控制致病因素，加强护理，防治并发症。积极进行早期功能康复、针灸治疗，降低致残率。

3.研究方法：(1)本研究为队列研究，比较194例维吾尔族缺血性脑卒中不同基因型患者经治疗后症状改善情况，以及影响其预后的危险因素。获得新疆医科大学伦理委员会的批准，入选者均签署知情同意书。(2)所有研究对象均提供了完整真实的临床资料，包括性别、年龄、体重、身高、吸烟饮酒史、家族史、既往疾病史、血压、血脂、血糖等血液检查指标，头部CT和(或)MRI等影像学检查资料。(3)在患者就诊入院时及住院治疗2周后均由神经内科专业医生采用美国国立研究院脑卒中评定表(NIH stroke Seale,NIHSS)进行评分，并根据《美国成人卒中康复治疗指南(2007)》及相关文献建议:以2周后NIHSS<6为预后良好，NIHSS≥6为预后不良进行分组[13]。(4)在每位研究对象知情同意后，抽取受检者清晨空腹静脉血4ml，EDTA抗凝，-80℃保存，用北京百泰克中量全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。应用限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(RFLP-PCR)方法进行检测，根据国外研究资料并结合数据库(NCBI database)查出位点的RS号，由上海生工生物工程技术有限公司合成,上游引物序列5＇-GGC TTT ATG GTT AAA TGC AAG G-3＇，下游引物序列5＇-GAG AGT AGG ATG AAG GGC TGA A-3＇。该序列所扩增产物为431bp，其包含一个对应于内切酶TaqαⅠ酶切位点。PCR反应体系：总体积为20μl，包含上下游引物各0.5μl，基因组DNA 1μl，Mix 10μl(含有3mmol/L MgCl2、0.4mmol/L dNTP和2×PCR缓冲液)，去离子水8μl。PCR扩增参数:95℃预变性3min；反应循环:95℃变性30s；59℃退火1min，27个循环后；最后72℃继续延伸5min后降至4℃终止。检测PCR扩增产物后，取PCR产物10μl,10×Buffer 2μl，TaqαⅠ酶0.5μl，灭菌去离子水补充体积至20μl，置于65℃水浴箱消化15min后，经5%琼脂糖凝胶电泳，110V电压，经30min电泳分离后。EB染色并于紫外灯下观察，凝胶成像系统(Unvitec,BTS-20M)照相、分型。并结合酶切结果，取部分PCR产物，送至上海生工进行DNA测序。(5)所有患者临床资料统一整理后录入数据库，并多次核对无误。

4.统计学方法：所获数据采用SPSS 17.0软件包进行处理。先行正态性和方差齐性检验，正态分布的计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验；多因素分析采用二分类Logistic逐步回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.临床资料：194例急性缺血性脑卒中患者，男女性别比例为115∶79，患者年龄18～91岁,患者平均年龄60.90±11.98岁。

2.ALOX5AP基因SG13S32位点多态性检测：ALOX5AP基因SG13S32位点以TaqαⅠ酶切PCR产物时，共有两种基因型，即不能被切开，仅可见一431bp片段，与PCR扩增产物大小相同的突变纯合子：AA基因型，共8例；被切割为431bp片段、241bp及190bp 3个片段的突变杂合子,AC基因型，共186例。

3.维吾尔族缺血性脑卒中ALOX5AP基因SG13S32位点不同基因型患者2周后NIHSS评分比较。194例维吾尔族缺血性脑卒中患者入院及治疗2周后NIHSS比较，差异有统计学意义(t=9.885，P=0.000)，认为入院时NIHSS评分数值较高，说明缺血性脑卒中经治疗后NIHSS评分降低，治疗有效。为影响预后相关危险因素研究提供前提条件。以两周后NIHSS<6为预后良好组，NIHSS≥6为预后不良组，经统计学分析后发现，不同基因型间缺血性脑卒中短期预后改善差异无统计学意义(χ2=0.336，P=0.562，表1)。

表1 ALOX5AP基因SG13S32位点不同基因型间患者2周后NIHSS比较

4.短期预后多因素分析:以两周后NIHSS<6为预后良好组，NIHSS≥6预后不良组，以性别(X1)、年龄(X2)、基因型(X3)、BMI(X4)、高血压病史(X5)、高脂血症史(X6)、糖尿病史(X7)、卒中家族史(X8)、就诊时间(X9)、空腹血糖(X10)、总胆固醇TG(X11)、高密度脂蛋白HDL(X12)、纤维蛋白原(X13)、TOAST分型(X14)作为自变量进行Logistic回归分析。年龄、就诊时间及纤维蛋白原为影响急性缺血性脑卒中患者独立的预后因素，建立的回归方程：logitP=1.092-0.03X2-0.006X9+0.895X13，性别、基因型、BMI、高血压病史、高脂血症史、糖尿病史、卒中家族史、空腹血糖、总胆固醇(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、TOAST分型未进入回归方程(表2)。

表2 影响急性缺血性脑卒中患者独立的预后因素

因变量及赋值.2周后NIHSS评分,以NIHSS<6 赋值为0,NIHSS≥6赋值为1;自变量赋值.纤维蛋白原(g/L)，2～4=0，>4=1，<2=2

讨 论

急性缺血性脑卒中50%～70%患者在运动、感觉和语言表达等遗留有不同程度功能障碍,严重影响了患者的身体健康和生活质量，给社会和家庭带来沉重负担。缺血性脑卒中临床上通常分为急性期，恢复期及后遗症期，而急性期(一般指发病后两周内)为整个治疗过程中的最佳时期，能有效改善和恢复缺血区的血液供应，促进脑微循环，挽救缺血半暗带，减少脑细胞死亡数目[14]。对于急性缺血性脑卒中患者病情进行正确评估，有助于指导医护人员制定合理有效的治疗方案，以使患者收到最好的疗效，降低致残率及死亡危险性。

美国国立研究院脑卒中评定表是1989年由Thmos等为了急性脑卒中治疗，研究设计的一份由15个项目组成的神经功能检查量表，国内外均认为其内容全面，对脑卒中患者的意识水平及视觉、运动、感觉小脑功能缺损程度进行综合性评价，可信度高，适用于各种脑卒中类型。且国内外大多数文献表明NIHSS评分与急性脑卒中患者病情预后严重程度的关系,即评分≥6分者病情较危重,死亡的风险较高,<6分者则预后较好[15]。

本研究中急性缺血性脑卒中患者在入院时及治疗2周后均由神经科专科医师对其进行神经功能缺损评价。经统计学分析结果发现在治疗前及治疗后的NIHSS评分的差异具有统计学意义，治疗后NIHSS评分低于治疗前NIHSS评分，说明经治疗后急性缺血性脑卒中患者病情得到改善。在患者接受治疗有效的前提下，鉴于维吾尔族患者的民族差异性，考虑5-脂氧合酶激活蛋白基因SG13S32位点不同基因型间急性脑卒中患者短期预后是否具有差异性。以住院治疗2周后的NIHSS评分<6为预后良好，NIHSS≥6为预后不良分组比较，5-脂氧合酶激活蛋白基因SG13S32位点不同基因型间维吾尔族急性缺血性脑卒中患者短期预后改善差异无统计学意义，即不同基因型间维吾尔族急性缺血性脑卒中患者短期预后改善无明显差异。提示此基因型之间经过有效治疗后在预后改善方面差异无统计学意义。但因其中AA基因型仅出现8例，群体代表性欠佳，可能造成一定误差。故仍需在以后实验中进一步扩大样本量，验证目前实验结论。

关于影响急性缺血性脑卒中预后的因素研究较多。研究表明，患者发病年龄、文化程度、脑梗死面积、部位及并发症均是影响急性脑梗死预后的主要因素[16，17]。而杨翠英等[18]也指出代谢综合征、TOAST分型、感染等是影响急性缺血性脑卒中预后的独立危险因素。本研究通过对194例维吾尔族缺血性脑卒中患者进行了短期预后多因素Logistic回归分析发现，5-脂氧合酶激活蛋白基因SG13S32位点基因型并未进入回归方程，提示其并不是维吾尔族急性脑卒中患者短期预后的独立危险因素。而TOAST分型亦未进入回归方程，与杜敢琴等[15]研究发现一致，均认为TOAST分型不是影响急性缺血性脑卒中预后的独立危险因素。但本研究中因需排除对5-脂氧合酶激活蛋白基因具有干扰性的疾病，TOAST分型中的心源性栓塞型(CE)及其他明确病因型(SDE)均未纳入研究，故目前结论仅适用于其余3种分型。

本研究发现，新疆地区急性脑卒中维吾尔族患者的短期预后的独立影响因素主要为发病年龄、就诊时间、纤维蛋白原。此研究发现与Hankey等结论相同，均发现年龄是预测脑卒中病死率重要的独立危险因素，指出急性缺血性脑卒中患者年龄与预后不良呈正比，即年龄越大，其不良预后发生率越高，伤残率及病死率均有提高。而单慧勇通过分析比较100例急性缺血性脑卒中患者发现，急性缺血性脑卒中患者的早期治疗能明显降低病死率和致残率。认为缩短就诊时间为可明显提高急性缺血性脑卒中预后改善。另外目前大量研究还证明，高纤维蛋白原水平对疾病预后的影响等同甚至已超过高胆固醇血症、高血压等一些已公认的危险因素。本研究发现纤维蛋白原是维吾尔族急性缺血性脑卒中患者的短期预后的独立影响因素，考虑与其致病机制有关。纤维蛋白原是由肝脏合成、分泌的一种蛋白，对血液流变学、血小板聚集和血管内皮细胞功能有重要影响，参与动脉粥样硬化形成，可导致血管粥样斑块巨噬细胞帽的渗透性改变和斑块帽变薄，能增加红色血栓的形成，易引发缺血性脑卒中。若持续保持高纤维蛋白原水平，则可能继续导致血栓形成及引起抗血小板聚集治疗效果欠佳，对狭窄、闭塞血管再通造成困难。故考虑临床治疗中积极降低纤维蛋白原，理论上可改善急性缺血性脑卒中患者预后情况。

本研究从基因水平考虑维吾尔族急性缺血性脑卒中患者短期预后相关危险因素，但未明确发现5-脂氧合酶激活蛋白基因SG13S32位点不同基因型间急性缺血性脑卒中患者短期预后改善有差别，亦未发现是新疆维吾尔族急性缺血性脑卒中患者短期预后相关危险因素。但由于目前样本量偏少，存在实验误差，故仍不能排除此基因型与缺血性脑卒中预后改善无关联，可于将来扩大样本量，继续进行此方面研究。另外还需缩短就诊时间，积极使用降纤药物，降低纤维蛋白原，提高纤溶活性，做好脑血管疾病的二级预防工作，减少急性缺血性脑卒中发生，有效降低病死率及致残率。

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(修回日期：2015-02-26)

Xinjiang Uygur Short-term Prognosis of Acute Cerebral Ischemic Stroke and 5-lipoxygenase-activating Gene SG13S32 Locus Polymorphisms，Risk Factors of the Correlation Research.

LiuMeng,YinLixin,MAJianhua,etal.

DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Xinjiang830054,China

Objective To investigate the relationship between the short-term prognosis of ischemic stroke in Uygur Xinjiang and SG13S32 locus of 5-lipoxygenase-activating(ALOX5AP) gene，age, gender, visiting time and so on. Methods One hundred and ninety-four Uygur patients who got acute ischemic stroke have the same drug therapy in Xinjiang.The SG13S32 locus ploymorphisms of ALOX5AP gene was determined by using PCR-restriction fragment length polymorphism technique. Cohort study is used to analyze the short-term prognosis of different genotypes. The independent prognostic factors was obtained by theLogisticanalysis. Results There were no statistical differences in the short-term prognosis of acute ischemic stroke among different genotypes of ALOX5AP gene SG13S32(χ2=0.336，P=0.562).TheLogisticsregression analysis by which we can get that age, visiting time and fibrinogen are independent prognostic factors in acute ischemic stroke in Uygur. Conclusion The short-term prognosis of acute ischemic stroke in Uygur whose independent risk factors is not the ALOX5AP gene SG13S32 but the age, visiting time and fibrinogen were independent risk factors.

5-lipoxygenase-activating gene; Stroke; Uygur; Short-term prognosis

国家自然科学基金资助项目(81060097)

830054 乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院神经内科

马建华，电子信箱：mjh9191@163.com

R74

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.033

2015-01-24)