壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌移植瘤细胞磷脂酰肌醇3-激酶的影响

曹建雄， 姚 菲， 何迎春， 毕四丽， 王文美， 何 丹， 柳景红

论 著

壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌移植瘤细胞磷脂酰肌醇3-激酶的影响

曹建雄， 姚 菲， 何迎春， 毕四丽， 王文美， 何 丹， 柳景红

目的 探讨壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌转移瘤细胞磷脂酰肌醇3-激酶的作用。方法 32只裸鼠随机等分为壮骨镇痛胶囊预防组、壮骨镇痛胶囊治疗组、参一胶囊阳性药物对照组和模型组，每组8只，接种乳腺癌细胞MDA-MB-231制备移植瘤，药物干预后，采用免疫组织化学染色法检测各组裸鼠移植瘤细胞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)的表达水平。结果 与模型组比较，各药物组瘤重均显著减轻(均P<0.05)，且预防组瘤重显著低于治疗组和参一胶囊阳性对照组(均P<0.05)；各药物组PI3-K表达水平均显著低于模型组(均P<0.05)，并且预防组PI3-K表达水平显著低于参一胶囊阳性对照组和壮骨镇痛胶囊治疗组(均P<0.05)。结论 壮骨镇痛胶囊能够抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生长，其作用可能与抑制磷脂酰肌醇3-激酶表达水平相关，预防组较治疗组疗效更佳。

壮骨镇痛胶囊； 乳腺癌； 磷脂酰肌醇3-激酶； PI3-K

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁妇女健康和生命。整合素是重要的细胞表面受体，通过胞内域将信号传给细胞骨架蛋白来介导细胞与细胞以及细胞与细胞外基质间的黏附，并接受和传导级联信号调节细胞的存活、增殖、运动等生物学行为[1]。目前，研究已表明，整合素与乳腺癌的发生发展以及晚期转移密切相关，其作用机制是现今肿瘤领域研究的热点之一。

调节整合素信号转导通路相关指标的表达可以改变细胞间的跨膜糖蛋白，改变细胞跨膜膜受体，控制级联信号传导，影响细胞黏附迁徙。采用相应的干预措施影响乳腺癌细胞跨膜糖蛋白，可使级联信号传导受到影响，相应的生物学表型特征发生变化，从而影响瘤细胞的侵袭与转移潜能[2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3-K)可引起细胞壁肌动蛋白丝结构重组，从而增强细胞的迁移及侵袭能力，是整合素依赖性信号转导通路中的基础，在整合素介导的相关信号转导途径中起着关键作用。

我院长期运用壮骨镇痛胶囊改善乳腺癌患者的预后，前期临床研究表明，复方壮骨镇痛胶囊对乳腺癌转移性骨疼痛具有较好的止痛作用，并且能够缩小转移病灶[3]。本研究拟通过观察壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌移植瘤PI3-K的影响，探讨壮骨镇痛胶囊对乳腺癌转移的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 32只BALB/c裸小鼠，体重18～22 g，SPF级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号为SCXK(湘)2009-0004。裸鼠喂养于SPF三级动物实验室，饲料及实验室均由湖南中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 细胞株 高转移人乳腺癌细胞MDA-MB-231，购自中南大学湘雅医学院现代实验中心细胞库。

1.1.3 药物 壮骨镇痛胶囊由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备，生产批号20101018，规格0.45 g×24粒/瓶。取壮骨镇痛胶囊0.45 g，先将胶囊去壳，内容物用10 ml无菌生理盐水溶解摇匀，制成0.045 g/ml药液，供裸鼠灌胃用。参一胶囊由吉林亚泰制药股份有限公司生产，生产批号Z20030044，规格0.01 g×16粒/盒。取0.04 g 溶于10 ml生理盐水中，制成0.004 g/ml药液，供裸鼠灌胃用。

1.1.4 试剂 二甲基亚砜(DMSO)由北京鼎国公司生产；RPMI-1640培养基胰蛋白酶粉由北京中杉生物技术公司生产；新生小牛血清由杭州四季青公司生产；青霉素、链霉素由大连美罗制药厂生产；即用型SABC免疫组化试剂盒、兔抗人FAK多克隆抗体、DAB显色试剂盒均由武汉博士德公司生产。

1.1.5 主要仪器 电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温培养箱、超声波清洗器均由上海新苗医疗器械公司生产；80-2型离心机由上海手术器械厂生产；AE31型倒置显微镜由Motic公司生产；电热恒温水浴箱由津泰斯特公司生产；高压蒸汽消毒器由山东新华医用器械厂生产；GB204型电子天平由瑞士特勒公司生产；Motic Med 6.0数码医学图像分析系统由Motic公司生产。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组 将购买并培养高转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231及BALB/c裸小鼠32只于三级SPF动物室检疫1周。将新购买的乳腺癌细胞加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液后放于37 ℃、5%CO2条件下培养，并进行细胞传代。待乳腺癌细胞长满培养瓶，将其用D-Hank’s液洗涤后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，取少许RPMI-1640培养液吹打成细胞悬液，并将乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞制成细胞悬液于裸小鼠前腋皮下接种，建立人乳腺癌皮下移植瘤模型。32只裸小鼠根据EXCEL软件生成的随机数字，随机分为4组：壮骨镇痛胶囊预防组、壮骨镇痛胶囊治疗组、参一胶囊阳性药物对照组和模型组，每组8只。接种后，每天观察裸鼠的一般情况及移植瘤的生长情况。

1.2.2 药物处理 灌胃用药干预前，各组裸鼠均在SPF三级动物房适应环境1周。1周后各组裸鼠接种乳腺癌细胞，预防组裸鼠于接种后第1天开始即用壮骨镇痛胶囊药液灌胃，模型组予以等体积生理盐水灌胃，该两组灌胃一直持续到壮骨镇痛胶囊治疗组及参一胶囊阳性对照组灌胃结束，前后共灌胃28天。壮骨镇痛胶囊治疗组及参一胶囊阳性对照组裸鼠则暂不作处理。根据人和动物的体重，折算出等效计量给药，壮骨镇痛胶囊预防组和治疗组的剂量标准约为0.5 g·kg-1·d-1，参一胶囊阳性药物对照组用量为0.3 g·kg-1·d-1，7天后壮骨镇痛胶囊治疗组和参一胶囊组开始给药，此时这两组裸鼠均已长瘤。治疗组和参一胶囊阳性对照组裸鼠每天灌胃1次，持续21天；21天后处死各组动物，分离移植瘤，分别切取标本制片。

1.2.3 指标检测 抑瘤率计算：处死裸鼠后，分离移植瘤，称量瘤体重量，将所得数据输入统计软件，计算抑瘤率。抑瘤率=(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。肿瘤细胞PI3-K测定：裸鼠处死后将移植瘤取下，用10%甲醛溶液浸泡，常规石蜡包埋，连续切片，进行常规的HE染色和免疫组化染色，观察乳腺癌移植瘤组织镜下表现，并计算肿瘤细胞PI3-K的表达情况。其中PI-3K显色在细胞质或细胞膜上，观察免疫组化处理后组织照片的棕黄色颗粒的数量，并用阳性细胞表示，通过Motic Med 6.0数码医学图像分析系统计算各指标的光密度值，并分别比较各组的表达差异。

2 结果

2.1 各组裸鼠瘤重比较

经过分析发现，参一胶囊组(0.5793±0.0340)g、壮骨镇痛胶囊预防组(0.3873±0.0464)g、壮骨镇痛胶囊治疗组(0.5700±0.0440)g，瘤重均显著轻于模型组(0.8975±0.0462)g(均P<0.05)，说明各用药组对裸鼠移植瘤生长起到一定的抑制作用。预防组瘤重轻于治疗组(P<0.05)。

2.2 各组移植瘤常规病理组织学HE染色变化比较

空白模型组细胞排列密集甚至重叠，呈铺路石样排列，细胞质少，细胞核呈圆形或椭圆形的泡状，大核仁位于中央，间质间淋巴细胞浸润，可见癌巢。各给药组可见癌细胞形态不规则，排列松散，多核，可见散在核固缩瘤细胞，有包膜完整的细胞碎片，瘤体中可见凝固性坏死，大量胶原纤维增生，可见凋亡小体。见图1。

图1 病理组织学变化比较(HE染色 ×400)(a空白模型组；b参一胶囊阳性对照组；c壮骨镇痛胶囊治疗组；d壮骨镇痛胶囊预防组)

2.3 各组移植瘤组织整合素黏附移植信号转导通路PI3-K表达活性免疫组化比较

免疫组化法测定PI3-K表达水平(光密度值表示)，比较各组表达活性及差异性。各组PI3-K表达水平存在显著差异(F=14.56，P=0.000)，与模型组比较，各用药组PI3-K表达水平显著降低(均P<0.05)。见表1及图2。

组别光密度值模型组30.75±4.58参一胶囊对照组11.56±1.98★壮骨镇痛胶囊治疗组23.57±5.76★☆壮骨镇痛胶囊预防组7.72±1.02★☆△

与空白模型组比较★P<0.05；与参一胶囊对照组比较☆P<0.05；与壮骨镇痛胶囊治疗组比较△P<0.05。

图2 PI3-K表达活性差异比较 (×400)(a空白模型组；b参一胶囊阳性对照组；c壮骨镇痛胶囊治疗组；d壮骨镇痛胶囊预防组)

3 讨论

壮骨镇痛胶囊是笔者治疗癌症多发转移的经验方，在湖南中医药大学第一附属医院肿瘤科已应用十余年，并已由本院制成了院内制剂使用至今，疗效反馈较好，对各种癌症转移特别是对晚期乳腺癌的骨转移效果显著[4]。

壮骨镇痛胶囊组方为骨碎补、仙灵脾、补骨脂、桑寄生、三七粉、莪术、延胡索、威灵仙、穿山甲、制南星、陈皮、芍药、甘草、制地龙、全蝎、蜈蚣。该方以骨碎补、补骨脂、仙灵脾、桑寄生为君药，补骨脂苦温入肝肾，补益肝肾同时能活血定痛；仙灵脾、桑寄生、补骨脂归肾经能增强君药补肾生髓之力；三七、莪术、延胡索、威灵仙及穿山甲共为臣药行气活血、散结通络、消肿定痛。制南星善消风痰、开结闭、止骨痛；地龙成能软坚而制约诸药之温热太过，并能通经活络引诸药至病所，故用其为使药；顽痹邪气久羁，深入经髓骨骱，气血凝滞不行，湿痰瘀浊胶固，经络闭塞不通，非草木之品所能宣达，必借虫蚁之类搜剔窜透，方能使浊去凝开，经行络畅，邪除正复，故方中义加用全蝎、蜈蚣以破瘀通络、搜剔定痛，以增强散结通络止痛、抗癌抑癌之效。佐以陈皮、白芍、甘草为佐药化痰行气、缓急止痛抗癌；壮骨镇痛胶囊全方体现了标本兼顾，补泄同用，扶正祛邪，抗癌抑癌的指导思想基础上，运用滋补肝肾、活血化瘀、消肿散结、行气止痛、以毒攻毒诸法合用以达到治疗肿瘤及其转移，是治疗肿瘤及抑制肿瘤转移的有效药物之一。

壮骨镇痛胶囊的研究包括临床研究和实验室研究，前期临床研究应用壮骨镇痛胶囊治疗乳腺癌晚期转移，研究结果表明，中药复方壮骨镇痛胶囊对乳腺癌转移性骨疼痛具有较好的止痛作用；且具有缩小转移病灶的作用[3，5-6]。

本实验研究证实，壮骨镇痛胶囊预防组、壮骨镇痛胶囊治疗组及参一胶囊阳性对照组对人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长均有抑制作用，但以壮骨镇痛胶囊预防组更为明显。在抑制PI3-K的表达方面，壮骨镇痛胶囊预防组疗效最好，壮骨镇痛胶囊中药治疗组及参一胶囊阳性对照组均起到明显抑制PI3-K表达的作用。说明壮骨镇痛胶囊可抑制裸鼠移植瘤组织中PI3-K的表达。

综上所述，壮骨镇痛胶囊在促进肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞黏附迁移方面效果确切，值得进一步推广应用。

[1] 周文博, 刘如南.整合素在恶性肿瘤中表达及其意义的研究[J].中国医药指南, 2009, 7(19): 48-50.

[2] 李东梅, 冯玉梅.黏附分子介导的信号转导与乳腺癌转移[J].中华乳腺病杂志, 2009, 3(5): 549-558.

[3] 曹建雄, 柳景红.壮骨镇痛胶囊治疗骨转移癌痛临床研究[J].中国中医药, 2009, 7(3): 25-26.

[4] 柳景红, 毕四丽, 何迎春, 等. 壮骨镇痛胶囊对高转移性乳腺癌裸鼠移植瘤VEGF和MMP-9的抑制效应[J].湖南中医药大学学报, 2013, 33(7): 18-22

[5] 曹建雄, 许桂英.壮骨止痛散联合西药治疗骨转移性癌痛41例疗效观察[J].中国中医药科技, 2006, 1(13): 48-49.

[6] 柳景红, 曹建雄.补肾健脾、祛瘀化痰法治疗恶性肿瘤骨转移癌痛52例临床观察[J].中国中医药信息杂志, 2007, 4(8): 34-35.

Effects of zhuanggu zhentong capsule on the role of phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K) of nude mouse breast cancer metastatic tumor cells

CAOJianxiong,YAOFei,HEYingchun,BISili,WANGWenmei,HEdan,LIUJinghong

(1.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410007,China;2.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China;3.DepartmentofOrthopaedicandTraumatology,theFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410007,China)

LIUJinghong,E-mail: 2274674521@qq.com

Objective To discuss zhuanggu zhentong capsule on the role of phosphatidyl inositol 3-kinase of nude mouse breast cancer metastatic tumor cells.Methods 32 nude mice were randomly divided into four groups, named as the prevention group of zhuanggu zhentong capsule; the treatment group of zhuanggu zhentong capsule; the positive drug control group of shenyi capsule and the blank model group. Each group was consisted of eight nude mice. After the nude mice implanted breast cancer cells and drug intervention, we would calculate and contrast the inhibition rate of tumor and phosphatidyl inositol 3-kinase of tumor cells for each group of nude mice.Results Among the positive drug control group, the prevention group and the treatment，it was found that the inhibition to the growth and the expression of PI3-K in human breast cancer cells in nude mice transplanted tumor. But the effect of the prevention group of zhuanggu zhentong capsule was more apparent.Conclusions Zhuanggu zhentong capsule can restrain the activity of phosphatidyl inositol 3-kinase expressed in nude mouse.The effect of the prevention group is better than that of the treatment group.

zhuanggu zhentong capsule; breast cancer; phosphatidyl inositol 3-kinase; PI3-K

湖南省科技厅资助项目(2007TP4021)；湖南省科技厅资助项目(2010TT2020)；湖南省教育厅 基金项目(09C724)；湖南省自然科学基金项目(13JJ3103)

410007 湖南 长沙，湖南中医药大学第一附属医院 肿瘤科(曹建雄)； 410208 湖南 长沙， 湖南中医药大学(姚 菲，何迎春，毕四丽，王文美，何 丹)；410007 湖南 长沙，湖南中医药 大学第一附属医院 骨伤科(柳景红)

曹建雄，男，教授，主要从事肿瘤防治研究，E-mail： 857676480@qq.com

柳景红，男，主任医师，教授，主要从事骨病防治研究，E-mail: 2274674521@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.03.007

1674-4136(2015)03-0167-04

2015-02-04][本文编辑：李 庆]