徐州地区羊支原体性肺炎病原分离鉴定

王 兵 张林吉 康永刚（徐州生物工程职业技术学院 江苏 徐州 221006）

羊支原体性肺炎(MPSG)是由支原体所引起的一种高度接触性传染病，其临床特征为咳嗽、高热、渐进性消瘦，肺、胸和胸膜发生浆液性、纤维素性炎症为主要特征，取急性和慢性经过，病死率很高。徐州及其周边地区的养羊业在蓬勃发展，同时疫病时有发生，特别是羊支原体性肺炎对养羊业危害较大。2014年11月份，徐州丰县羊养殖户送来几只死羊，主述最近整群精神萎靡、消瘦、流鼻涕、有咳嗽、稀泻。发病率90%以上，死亡率22.3%，且每天不断有大量新死亡病例，用了大量的药物控制不住，寻求本院帮忙。

1 临床症状

羊群发病羊体温达41～42℃，病死羊眼角湿润，有些脓性分泌物，眼眶凹陷，口腔发生溃疡，皮毛干燥，肛门及附近毛被粪便污染。

2 病理变化

解剖检查：胸部肌肉红白相间，胸腔少量积液，一侧肺已经和肋骨发生粘连，同侧肺和膈肌也发生粘连，支气管与纵膈淋巴结充血、肿大。心包浑浊，附有大量纤维素样渗出物，肺严重淤血，肝上也有一薄层纤维素样渗出物包裹，肝小叶结构模糊，胆囊异常肿大，肾脏皮质出血，肾被膜发生粘连，不易剥离，结肠出血。

3 实验室诊断

3.1 培养基 支原体肉汤培养基、支原体琼脂培养基、马血清，均购自青岛海博生物技术有限公司，青霉素、常用染色液由徐州生物工程职业技术学院动物微生物实验室提供。

3.2 病料采集 无菌采集羊肺部病健交界处肺组织、肝脏组织，用无菌注射器抽取心包积液和胸腔积液。随即进行实验室病原分离培养。肝脏和肺脏组织样品、心包积液和胸腔积液样品的处理方法如下：用灭菌手术刀剔除肝脏和肺脏病料表面组织，取1cm3左右深层组织块，剪碎后加少量的支原体肉汤培养基研磨成乳剂，再将组织液分装于1.5ml的EP管中，2000r/min离心3～5min，取离心后上清以1:10比例接种于支原体肉汤培养基中，另取0.4ml上清液均勾涂布于支原体琼脂培养基平板上；心包积液和胸腔积液用0.45μm细菌过滤器过滤除菌后的滤液以1:10比例接种于支原体肉汤培养基中，另取0.4ml上清液均勾涂布于支原体琼脂培养基平板上。

3.3 支原体培养 接种的支原体肉汤培养基和支原体琼脂培养基在5%CO2、一定湿度和37℃下培养7～12d。每隔24h观察一次，如果发生污染，应及时用0.22μm的无菌滤器过滤后继续培养。将液体培养基颜色变黄的液体培养物盲传三代，再接种到固体培养基上培养和纯化；在光学显微镜下观察固体培养基上培养物的菌落形态，选取具有支原体菌落形态特征的单个菌落，用接种环挑取放入液体培养基中纯化和传代。重复该步骤3～5次，得到的支原体单菌落培养物。

3.4 形态学鉴定（1）用低倍光学显微镜观察纯化三代以上的疑似羊支原体在固体培养基上的菌落形态。（2）用培养3～5d的液体培养物玻板涂片，甲醇固定，姬姆萨染色3～5h，在光学显微镜下观察分离菌株菌体形态。

3.5 生理生化鉴定 参照陆承平(2001)提供的方法分别进行水解精氨酸试验、尿素分解试验、发酵葡萄糖试验、美蓝还原试验、菌落吸附红细胞试验。操作如下：（1）水解精氨酸试验：在支原体液体培养基加人10%葡萄糖，将pH调至7.6，分装于试管中。取液体培养物1.5ml接种于培养基中，设阴性对照管。37℃培养6～10d，试管颜色从紫红色变成黄色，pH值下降0.5单位以上，而对照管不变色时为阳性，二者均不变色为阴性。（2）分解尿素试验：在支原体液体培养基中加入10%尿素，将pH调至7.0，取液体培养物1.5ml接种于培养基中，设阴性对照管。37℃下培养5周。试验管从黄色变为红色而对照管不变色时为阳性，二者均不变色则为阴性。（3）发酵葡萄糖试验：在支原体液体培养基中加人10%的精氨酸， 将pH调至7.0，分装后接种，设阴性对照管。37℃培养6～10d，试验管颜色从黄红色变成紫红色，pH值上升0.5单位以上，而对照管不变色时为阳性，二者均不变色则为阴性。（4）美蓝还原试验：在支原体液体培养基中加0.1%美蓝溶液0.025ml，接种液体培养物0.5ml，设阴性对照管。37℃培养7～10d，观察试管颜色的变化。颜色变浅的为阳性，不变色的为阴性。（5）菌落吸附红细胞试验：将液体培养物Iml接种到固体培养基中，37℃培养6～7d后，在40倍光镜下检查菌落生长情况。在生长菌落的固体培养基表面，加入2ml0.25%鸡红细胞生理盐水悬液，室温作用而20min，弃去红细胞悬液，用生理盐水洗涤3～5次，在低倍镜下观察，菌落表面布满红细胞者为阳性，无红细胞者为阴性。

4 结果

4.1 分离培养结果 在病死羊体内共分离到2株疑似羊肺炎支原体菌株。2株均分离自病羊肺脏。

4.2 形态观察结果 纯化菌落显微镜观察，10倍物镜下可见具明显中心脐，边缘整齐，光滑。

4.3 生化鉴定结果 生化鉴定结果与相关文献报道的基本一致。能发酵葡萄糖、还原美兰，不分解尿素、不水解精氨酸、菌落不吸附0.25%的鸡红细胞。结果见附表：

附表 生化鉴定结果

4 小结

（1）秋末、冬末和春初由于气温骤变，养殖密度较高的、尤其是圈养的羊群中，本病较易发生和流行。（2）该病呈地方性流行，病羊是主要的传染源，飞沫传播是其主要传染方式，新疫区的爆发多是由于未经检疫的病羊的引进而发生的。该病传播速度较快，20d就可波及全群。冬季流行期平均20d，夏季在2个月以上。（3）发生病变的肺脏组织病原分离率比较高，病料的质量对羊支原体性肺炎的病原体的分离成功与否有重要影响。（4）本病常继发羊口疮性溃疡等其他疫病，所以对于新购羊务必进行隔离观察后再混群。本研究为徐州地区羊支原体肺炎耐药性研究奠定基础。

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