黔东南小香鸡ALV的流行病学调查及病毒的分离鉴定

赵香胜 李瑞典（河北省任丘市畜牧水产局 062550）

禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus,ALV)属反转录病毒科禽C型反转录病毒属成员，可引起禽类多种肿瘤性疾病[1]。该病毒可分为A到J10个亚群，临床上常见的为A、B和J亚型，而C、D亚型在临床上相对少见，E亚群主要以前病毒的形式存在于宿主基因组而广泛存在[2]。由于ALV病毒基因组变异较快，目前尚未有商业化疫苗可供使用，实施严格的净化措施是唯一有效的防控方法[3]。

近年来，随着我国对禽白血病病毒检测和防控力度的加强，我国白羽肉鸡和蛋用型鸡群祖代鸡ALV感染已得到有效控制。然而，我国地方品系鸡分布广泛，品种繁多，因此我国地方品系鸡禽白血病的防控和净化面临着较大挑战，ALV的感染和流行依然存在。同时，近些年中国地方品系鸡种的保护工作逐渐受到重视[4]。黔东南小香鸡是我国特有的地方品系鸡，羽毛色彩丰富多样，外表华丽，肉质细嫩香醇，市场前景良好。为了解我国黔东南小香鸡的ALV感染状况，为净化和保种工作提供技术支持，本研究对我国某地方品系鸡黔东南小香鸡保种鸡群进行了ALV的流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 材料（1）主要试剂和仪器：ALV抗原检测试剂盒，ALV-J、ALV-AB抗体检测试剂盒均购自IDEXX公司；病毒RNA提取试剂购自OMEGA公司；RT-PCR反应试剂、DL2000Marker、PMD-18T载体购自大连宝生物公司，其余常规试剂均为国产分析纯。（2）细胞：可区分内外源ALV的鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞由本实验室保存、传代。

1.2 血清ALV抗体和蛋清ALV抗原的检测 在该场240日龄的黔东南小香鸡保种鸡群中，随机抽取54只鸡(母鸡40只，公鸡14只)，每只鸡分别常规采血0.2～0.5ml，分离血清，使用IDEXX公司ALV抗体检测试剂盒分别检测ALV-J和ALV-AB特异性抗体。同时，收集该保种鸡群40枚鸡蛋，使用IDEXX公司ALV抗原检测试剂盒检测蛋清中ALVp27抗原。

1.3 病毒分离培养 将p27抗原阳性蛋清经0.24μm滤器过滤后接种DF1细胞系，维持7d后盲传一代，7d后取上清使用ALV抗原检测试剂盒(IDEXX公司)检测p27抗原，阳性者收集细胞上清和DF1细胞，所分离病毒置于液氮中保存，并将其命名为QDN-13。

1.4 细胞DNA的提取 将上清p27抗原阳性的DF1细胞用PBS清洗1-2遍，加500μl组织抽提液，5μl蛋白酶K，55℃消化过夜。用苯酚氯仿抽提提取DNA，50μlddH2O溶解，-20℃保存备用。

1.5 ALV的PCR扩增和克隆测序 根据参考文献[5]，使用针对env基因两侧保守区的通用引物，PCR扩增env基因的约1.9kb片段。引物如表1所示。PCR反应体系如下：10XPCRbuffer2.5μl， Mg2+*(25mM)2μl， dNTP(2.5mM)2μl，上下游引物各0.5μl，模板DNA2μl，rTaqDNA聚合酶0.5μl，ddH2015μl，共25μL。PCR扩增条件为：预变性95℃ 5min，变性95℃ 1min，复性55℃ 50s，延伸72℃2min，共30个循环，复延伸72℃10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测、回收，使用OMEGA凝胶回收试剂盒纯化PCR片段，与PMD-18T载体连接，转化DH5大肠杆菌，挑取白色菌落，酶切验证后挑选阳性克隆送上海生工测序。根据所得序列推导其gp85氨基酸序列。1.6 ZJ13-QDN-2分离株与各亚群参考株同源性和遗传进化树分析 使用DNAstar5.0软件对序列进行拼接、同源性分析和病毒的遗传进化树分析。用于比较的不同亚群ALV参考株及其信息见表2所示。

表1 PCR扩增引物序列

表2 各亚群参考株信息

2 结果

2.1 黔东南小香鸡ALV感染状况 血清抗体的检测结果表明，该保种鸡场的黔东南小香鸡保种鸡群存在着ALV-J和ALV-AB的混合感染。该群鸡ALV-AB的阳性率为16.70%，而ALV-J抗体阳性率仅为1.9%；并且，公鸡ALVAB抗体阳性率远远高于母鸡。蛋清ALV抗原检测结果表明，有高达27.50%的蛋清为P27抗原阳性，这表明，垂直传播在ALV的传播过程中发挥重要作用。

表3 黔东南小香鸡ALV抗原及ALV-JALV-AB抗体阳性率

2.2 蛋清中ALV的分离鉴定 将p27抗原检测阳性的蛋清接种DF1细胞，5%CO2，37℃培养箱中培养7d，收集细胞上清检测ALVp27抗原。对p27抗原阳性细胞使用ALVA/B单因子血清[6]和ALV-J单抗JE9通过IFA进行检测。结果表明，我们在阳性蛋清中分离到一株外源性ALV，并将其定名为ZJ13-QDN-2。

2.3 ZJ13-QDN-2分离株与参考株之间同源性和系统进化树分析 对ALV前病毒DNA的env基因克隆测序，并对序列进行比对分析，结果表明，SDAU14A1的gp85基因长度为1035bp，推导其编码344aa的gp85蛋白。序列比对表明，SDAU14A1的gp85氨基酸序列与A亚群ALV参考株之间同源性为93.1%(89.7%～98.0%)，与B亚群ALV参考株之间同源性平均值为79.5%(79.3%～79.8%)，与C亚群ALV参考株之间同源性为84.6%，与D亚群ALV参考株之间同源性为83.1%，与E亚群ALV参考株之间同源性平均值为84.4%(84.1%～84.7%)，与J亚群ALV参考株之间同源性平均值为38.3%。ZJ13-QDN-2的gp85氨基酸仅与A亚群ALV的同源性高于80%，与其他亚群同源性均较低。系统进化树也表明，我们分离到的ZJ13-QDN-2株属于A亚群ALV。值得注意的是，ZJ13-QDN-2的gp85在氨基酸水平上与分离自法国的MAV-1、分离自其余地方品系鸡的毒株LH091101A在同一进化枝上，这暗示，盲目引种及不当的饲养管理可能是造成该群鸡感染ALV-A的原因。

图1 ZJ13-QDN-2的gp85蛋白与其余参考株同源性比对

图2 ZJ13-QDN-2的gp85蛋白系统进化树

3 讨论

ALV是一种主要通过垂直传播的的反转录病毒，除了可以诱发鸡的肿瘤，ALV感染还可引起鸡产蛋下降和免疫抑制，给我国养禽业造成巨大经济损失[7]。经过十余年努力，虽然我国的白羽肉鸡和蛋用型祖代鸡基本实现了ALV的净化，但由于饲养管理不善、缺乏严格的监控措施等多种原因，ALV在我国地方品系鸡中仍呈现大规模感染和局部流行的态势。继成子强在中国麻鸡中发现ALV-J的感染后，研究人员先后在山东寿光鸡、芦花鸡、百日鸡、琅琊鸡、鲁西斗鸡、广西黑鸡、龙胜凤鸡、广西三黄鸡、乌骨鸡等我国特有品系鸡中分离鉴定到ALV[8-12]。在这些鸡群中，普遍存在着ALV-J的感染，也有的品系表现ALV-A/B的流行，甚至共感染。在前期调查中，我国6个省的28个地方品系鸡中有22个地方品系鸡ALV-A、ALV-B抗体呈现阳性，23个地方品系鸡对ALV-J抗体呈阳性。这表明，我国地方品系鸡中ALV的净化防控任务依然艰巨。

本研究通过对我国某保种鸡场的黔东南小香鸡保种鸡群进行ALV的流行病学调查，以期为ALV的净化工作提供依据，为我国优良品系鸡的保种工作提供保障。血清流行病学调查的结果表明，在该群鸡中，存在着ALV-J和ALV-AB的混合感染，以ALV-AB的感染为主，并且，公鸡中ALV-AB抗体阳性率显著高于母鸡。有研究表明，公鸡的精液可以作为ALV传播的载体，这提示我们在对该群鸡ALV净化中，需要加强对公鸡的检测淘汰力度。本研究将ALV抗原阳性蛋清接种DF-1细胞，成功分离到一株外源ALV病毒，env基因的克隆测序结果表明，ZJ13-QDN-2分离株为A亚群ALV，这与血清学调查的结果相吻合。Gp85序列分析和系统进化树分析表明，该分离株与分离自法国的MAV-1、分离自其余地方品系鸡的毒株LH091101A在同一进化枝上，它们之间具有较高的同源性。这暗示，该分离株有可能是在国外引种过程中带入我国的。由于引种时检疫不严，引种后管理不善，使得病毒感染了鸡场的该鸡群。另外，需要指出的是，本研究在该黔东南小香鸡保种鸡群中仅分离到A亚群ALV，但并不能排除该鸡群中其他亚群的感染。该鸡群ALV-J抗体阳性率为1.90%，表明该鸡群可能曾经或者正在经历ALVJ的感染。

总之，本研究对我国某保种鸡场的黔东南小香鸡保种鸡群进行了ALV的流行病学调查，并在ALV抗原阳性的蛋清中分离到一株A亚群ALV。这为黔东南小香鸡ALV的净化、优良品种的保藏培育提供了技术支持，也给研究黔东南小香鸡ALV的来源、遗传关系提供了有力的材料。我们需要加强对该黔东南小香鸡保种鸡群ALV的检测力度，实施更加严格的净化淘汰措施，同时加强饲养管理，避免ALV在鸡群中的横向传播，为全面提高种禽健康水平奠定基础。

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