黄芪多糖对异丙肾上腺素诱发的SERCA2a表达及活性降低的影响

戴红良，贾桂枝，赵 颂，赵 艳，张晓红，王洪新

(辽宁医学院 1.护理学院、2.辽宁省心脑血管药物研究重点实验室、3.生物化学与分子生物学教研室、4.科学实验中心，辽宁 锦州 121001)

黄芪多糖对异丙肾上腺素诱发的SERCA2a表达及活性降低的影响

戴红良1,2，贾桂枝3，赵 颂4，赵 艳4，张晓红3，王洪新2

(辽宁医学院 1.护理学院、2.辽宁省心脑血管药物研究重点实验室、3.生物化学与分子生物学教研室、4.科学实验中心，辽宁 锦州 121001)

目的 探讨黄芪多糖对异丙肾上腺素(isopreterenol, ISO)刺激下心肌细胞SERCA2a表达的影响。方法 采用Real-time PCR法检测SERCA2a mRNA的表达；利用蛋白质免疫印迹法检测SERCA2a蛋白的表达。以4-硝基酚磷酸二钠(p-NPP)法检测SERCA2a的活性。结果 与对照组相比，ISO组心肌细胞SERCA2a mRNA及蛋白的表达均明显降低，而黄芪多糖剂量依赖性地逆转上述降低。此外，黄芪多糖还可明显提高SERCA2a的活性。结论 黄芪多糖可缓解ISO引起的SERCA2a表达及活性的下调。该作用可能是黄芪多糖缓解心肌细胞内Ca2+超载，进而发挥其心血管保护作用的重要机制。

黄芪多糖；心肌细胞；异丙肾上腺素；Ca2+超载；SERCA2a；心肌保护

黄芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)是补气中药黄芪的有效成分之一。具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[1-3]。研究发现，APS具有明显的心血管保护效应。APS经口服给药后对糖尿病心肌病及心肌肥厚等都有一定的改善作用[4]。我们最近的研究证实，APS抗肥厚的机制与其对细胞内Ca2+超载的抑制作用有关[5]。但对其抑制Ca2+超载的机制尚不明确。研究发现黄芪注射液可明显抑制肌质网/内质网Ca2+-ATP酶2a(sarco/endoplasmic reticulum 2a, SERCA2a)的表达[6]，APS对糖尿病心肌病心脏SERCA2a表达也呈现明显抑制效应[7]，于是，我们推测APS的抗心肌细胞Ca2+超载效应可能与其抑制SERCA 2a的表达有关。本研究将探讨APS对SERCA2a表达及活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物出生1～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，♀♂不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂APS购自陕西森弗生物技术有限公司(纯度大于98%)。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶、DMEM低糖培养基、异丙肾上素素(isopreteronol， ISO)、4-硝基酚(p-NP)、4-硝基酚磷酸二钠(p-NPP)均购于美国Sigma公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)蛋白定量试剂盒美国Pierce公司；SERCA2a一抗购于美国Promega公司；β-actin一抗购于美国Sigma公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxide, HRP)标记的二抗购于美国Santa Cruz公司。TRIzol 试剂购自美国Invitrogen公司，引物由上海生工生物技术有限公司合成，逆转录及实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 新生大鼠心肌细胞原代培养新生大鼠心肌细胞原代培养方法，参照文献[8]。 取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，开胸取出心脏，用D-Hanks液冲洗3次后剪成约1 mm3大小的碎块，在37 ℃条件下，以0.8 g/L胰蛋白酶消化分离细胞。将消化完毕的细胞以差速贴壁法进行纯化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合后，换以含0.04%胎牛血清的DMEM，继续培养24 h后，将细胞分组用于实验。

1.4 Real-time PCR测心肌细胞内SERCA2a mRNA的表达采用TRIzol提取细胞中总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA的浓度和纯度，要求A260/A280=1.8～2.0。cDNA合成：0.5 μg RNA, 25℃、10 min，48℃、30 min，95℃、5 min。采用SYBR Green I荧光染料，参照试剂盒说明完成qPCR。目的基因SERCA2a上游引物为5′-TCTGACTTTCGTTGGCTGTG-3′,下游引物为5′-GCCTTTGTTATCCCCAGTGA-3′,内参基因β-actin上游引物为5′-TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTA-3′,下游引物为5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′。PCR反应条件为：预变性95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s 40个循环。独立实验重复3次，采用相对定量法(comparative delta-delta Ct)定量。

1.5 Western blot测心肌细胞内SERCA2a蛋白的表达收集细胞，加细胞裂解液RIPA[( 1%乙基苯基聚乙二醇 (nonidet P 40, NP-40)，0.5% 脱氧胆酸钠，l%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)，0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF)] 提取细胞总蛋白，2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白浓度。取50 μg总蛋白，以1×样品缓冲液配平上样体积，沸水煮5 min后置10% SDS-PAGE中进行电泳，待电泳完成后电转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用5%脱脂牛奶封闭1 h，接着加SERCA2a及GAPDH一抗4 ℃孵育过夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP标记的二抗室温孵育2 h。TBS-T洗膜后，化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)显色。 利用美国国立卫生研究院(national institutes of health，NIH) ImageJ 1.42软件对扫描的条带进行灰度分析。

1.6 SERCA2a活性检测心肌细胞在4℃匀浆，12 000 r·min-1离心20 min后，收集上清进行蛋白定量及SERCA2a的活性检测。20 μl 上清加入100 μl 反应体系 (mmol·L-1：MgCl21.5， EGTA 1.5，KCl 150，HEPES 20，0.01%TritonX-100，含或不含CaCl26.5；pH 7.4)中。37℃孵育10 min后加入100 mmol·L-14-硝基酚磷酸二钠(p-NPP)10 μl，再孵育30 min后加入2 ml 反应终止液 (500 mmol·L-1Tris，55 mmol·L-1EDTA)。用分光光度计在波长405 nm处读取光密度值，并通过4-硝基酚(p-NP)标准曲线进行换算。SERCA2a活性用每分钟每克蛋白产生的p-NP的微摩尔数(μmol·g-1·min-1)表示。

2 结果

2.1 APS对心肌细胞SERCA2a mRNA表达的影响与正常组比较，心肌细胞经10 μmol·L-1ISO处理48 h后SERCA2a mRNA表达明显降低。APS能剂量依赖性地缓解此种降低，见Fig 1。

2.2 APS对心肌细胞SERCA2a蛋白表达的影响与正常组比较，心肌细胞经10 μmol·L-1ISO处理48 h后SERCA2a 蛋白表达明显降低。APS能剂量依赖性地缓解此种降低，见Fig 2。

Fig 1 Effect of APS on expression of SERCA2a mRNA in rat cardiac myocytes(n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group.

Fig 2 Effect of APS on expression of SERCA2a protein in rat cardiac myocytes (n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group.

2.3 APS对心肌细胞SERCA2a活性的影响与正常组比较，心肌细胞经10 μmol·L-1ISO处理48 h后，SERCA2a活性明显降低。APS能剂量依赖性地缓解此种降低，见Fig 3。

3 讨论

Ca2+超载是指细胞内Ca2+的异常性升高。在正常情况下，Ca2+作为一个重要的细胞内第二信使，在心肌电活动及兴奋-收缩偶联中发挥着必不可少的作用。在正常情况下，心肌细胞内的Ca2+浓度是受到多种机制的严密调控的。当心肌细胞因去极化兴奋时，Ca2+循细胞膜上的内向钙电流(inward Ca2+current, ICa)进入心肌细胞，进入的Ca2+又诱导细胞内肌质网Ca2+向胞质的进一步释放，最终引起心肌细胞内的游离Ca2+浓度升高。当Ca2+浓度升高到一定程度时即引起心肌的收缩。接着， Ca2+又转运出胞质，从而使心肌舒张。目前已发现有4条通路负责胞质内Ca2+的恢复，即内质网钙泵、细胞膜Na+/Ca2+交换体、细胞膜钙泵和线粒体Ca2+单向输送体[9]。当上述各种调节细胞内Ca2+浓度的机制发生异常时，便可导致细胞内Ca2+浓度的异常升高，即出现Ca2+超载。

Fig 3 Effect of APS on SERCA2a activity (n=5)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group.

各种心血管异常表现如缺血/再灌注损伤、心律失常、心肌细胞肥大及凋亡等都与心肌细胞内的Ca2+超载密切相关[10-13]。我们之前研究发现黄芪多糖能够明显抑制ISO作用下心肌细胞内的舒张期Ca2+超载。本实验在此基础上进一步探讨黄芪多糖改善Ca2+超载的机制。研究发现，92%舒张期胞质内Ca2+浓度的恢复依赖于SERCA2a的重摄取[14]。ISO是诱发SERCA表达及活性降低的重要因素[15]。最近发现APS可抑制糖尿病心肌病心脏SERCA2a的表达[7]。我们在本研究中检测了APS对ISO作用下SERCA2a表达及活性的影响。结果显示，ISO明显地降低了SERCA2a的mRNA及蛋白的表达及其活性，而APS能够剂量依赖性逆转上述改变。表明APS可以阻止ISO引起的SERCA2a mRNA及蛋白水平的下调，从而维持SERCA2a摄取静息期Ca2+的能力，缓解心肌细胞内Ca2+超载。

总之，本研究发现，APS可缓解ISO引起的SERCA2a表达及活性的下调。该作用可能是APS缓解心肌细胞内Ca2+超载，进而发挥其心血管保护作用的重要机制。

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Effect of astragalus polysaccharide on isopreterenol induced SERCA2a expression and activity downregulation

DAI Hong-liang1,2, JIA Gui-zhi3, ZHAO Song4, ZHAO Yan4, ZHANG Xiao-hong3, WANG Hong-xin2

(1.SchoolofNursing, 2.LiaoningProvincialKeyLaboratoryofCardiovascularandCerebrovascularDrugResearch, 3.DeptofBiochemistryandMolecularBiology, 4.CentreofScientificExperiment,LiaoningMedicalUniversity,JinzhouLiaoning121001,China)

Aim To explore the effect of astragalus polysaccharide (APS) on SERCA2a expression and activity in cardiac myocytes under isopreterenol (ISO) stimulation. Methods SERCA2a mRNA and protein expression were evaluated by real-time PCR and Western blot, respectively. SERCA2a activity was determined by p-NPP method. Results Compared with control, cardiomyocytes in ISO group exhibited significantly decreased expression of SERCA2a both in mRNA and protein levels. APS reversed these decreases in a dose-dependent manner. Furthermore, APS also significantly improved SERCA2a activity. Conclusions APS effectively buffers ISO induced downregulation of SERCA2a expression and activity. These effects appear to mediate APS’s cardiovascular protection against Ca2+overload.

astragalus polysaccharide; cardiomyocyte; isopreteronol; Ca2+overload; SERCA2a; cardioprotection

时间：2015-3-3 11:08 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.018.html

2014-11-08,

2014-12-24

国家自然科学基金资助项目(No 30973898)

戴红良(1982-), 男, 博士, 讲师，研究方向:心血管药理学, E-mail: jy2006hldai@sohu.com; 王洪新(1964-), 男, 博士, 教授，硕士生导师，研究方向:心血管药理学, 通讯作者，E-mail: jyhxwang@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.018

A

1001-1978(2015)03-0388-04

R-332；R284.1；R322.11；R348.1；R542.2；R977.6