美洲大蠊提取物对力竭运动大鼠心血管氧化损伤的保护作用*

马 俊， 曾远生， 刘 炜

(1. 重庆大学体育学院， 重庆 400044； 2. 重庆工商大学体育学院， 重庆 400067； 3. 重庆第二师范学院教师教育学院， 重庆 400067)



美洲大蠊提取物对力竭运动大鼠心血管氧化损伤的保护作用*

马 俊1△， 曾远生2， 刘 炜3

(1. 重庆大学体育学院， 重庆 400044； 2. 重庆工商大学体育学院， 重庆 400067； 3. 重庆第二师范学院教师教育学院， 重庆 400067)

目的：通过美洲大蠊提取物(PAE)对力竭运动大鼠心肌自由基代谢的影响，探讨其对心肌氧化损伤的保护作用。方法：雄性SPF级健康SD大鼠40只，随机分为安静组、运动组、美洲大蠊提取物安静组、美洲大蠊提取物运动组(n=10)。服药组每天灌服2 ml美洲大蠊提取物 (美洲大蠊提取物按50 mg/kg配制,溶于2 ml蒸馏水中灌胃给药)，对照组每次灌蒸馏水2 ml。每天灌胃1次，连续灌胃14 d后，美洲大蠊提取物运动组与运动组大鼠进行一次性力竭游泳运动建立力竭模型，记录大鼠力竭运动时间。力竭运动结束时即刻取样，检测血清中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，并检测观察心肌组织中一氧化氮合酶(NOS)基因的表达情况。结果：与安静组相比，一次力竭游泳后, 运动组心肌SOD、GSH-Px 的活性明显降低(P<0.01), 而MDA 含量显著升高(P<0.01); 而美洲大蠊提取物能够显著提高力竭SD大鼠的心肌SOD、GSH-Px的活性(P<0.01), 降低MDA 含量(P<0.01)，eNos基因表达增高。结论：大鼠力竭运动后心肌会发生氧化损伤，美洲大蠊提取物干预后能够增加力竭运动后大鼠心肌的抗氧化能力，对力竭运动所致心肌损伤具有一定的保护作用，进而增强大鼠运动能力。

美洲大蠊提取物；大鼠；力竭运动；心血管；氧化损伤

periplaneta Americana extract; rats; exhaustive exercise; cadiovascular; oxidative damage

美洲大蠊俗称蜚蠊，又称蟑螂等，是蜚蠊科中体积最大的昆虫，原产于南美洲。它是一种传统的中药材。现代研究发现，美洲大蠊表皮含有巩膜质和甲壳质，钾、钙、铝、镁等元素。肌肉水解13种氨基酸。此外，身体不同部位分别含有丰富的甘氨酸、维生素、腺嘌呤等。据大量相关文献报道，美洲大蠊的醇提取物对癌细胞增殖具有明显的抑制作用，对心血管疾病的治疗有明显的效果[1]。人体在力竭运动时，机体能量需求量急剧增加，心肌细胞能量代谢加速，容易引起冠

状动脉供血不足。心肌细胞缺血缺氧，诱发自由基(reactive oxygen species, ROS)的大量产生，导致运动性氧应激及心肌细胞膜的脂质过氧化损伤[2-4]，从而使机体运动能力下降。在正常情况下，生物体内存在的强大氧化-抗氧化平衡系统，可将自由基维持在一个稳定的范围内。当平衡系统受到破坏，体内自由基大量产生，导致细胞氧化损伤，促使细胞发生恶性转化。筛选一种高效无毒高效抗氧化剂已成为运动医学日益关注的焦点。目前在剧烈运动应激时，给予美洲大蠊提取物对心肌氧化损伤是否发挥作用的研究尚无报道。因此，本研究对处于力竭运动训练的SD大鼠灌服美洲大蠊提取物，通过心肌自由基代谢、抗氧化酶、心肌组织中MDA含量等指标的测定，探讨美洲大蠊提取物对力竭运动大鼠心肌过氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要仪器

选取40只SPF级健康SD雄性大鼠，体重(180±20)g，动物由第三军医大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(渝)2007-0003)。美洲大蠊干虫体(云南大理禾源宾馆美蠊养殖基地)；酪氨酸(中国药品生物制品检定所，批号：1687-200811)；硅胶G(上海原叶生物科技有限公司)；RT-PCR Kit(北京中杉金桥生物有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物有限公司)；Marker I (北京天根生物有限公司)；DZKW-4水浴锅上海科析试验仪器厂)；大鼠丙二醛(malondialdehyde, MDA)定量检测试剂盒(ELISA)、大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 定量检测试剂盒(ELISA)、大鼠谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)定量检测试剂盒(ELISA)；梅特勒电子天平AE240(瑞士)；岛津UV2550紫外-可见光分光光度仪(日本岛津)；1708176凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)；梯度PCR仪(Bio-Rad公司)；H-2050R台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 美洲大蠊提取物的制备[5]预处理虫体：分别用75%乙醇和蒸馏水缓和清洗美洲大蠊成虫干体表面各2次，去除触须和翅后，放入60℃烘箱烘干后，放置冻存盒里于-20℃冰箱中过夜保存。

水提：称取10 g虫体在碾钵中磨细后，加入蒸馏水10 ml再研磨成浆液，放置于-20℃冷冻20 min，如此反复研磨3次，使虫体充分被研磨成匀浆。

离心处理：将研磨后的虫体匀浆小心转移至50 ml离心管中，加入蒸馏水30 ml,以4 000 r/min离心15 min，去除上层油状物，取下层悬液用滤膜过滤，用蒸馏水反复冲洗滤膜3次，收集滤液。

浓缩醇析：水浴锅中加热(60℃～70℃)浓缩滤液至原有体积的1/4,室温冷却，以10 000 r/min离心10 min，去除上层油状物，过滤并清洗滤膜，滤液合并后水浴加热至60℃～70℃，趁热加入95%乙醇并不断搅拌，冷却至室温后，10 000 r/min离心15 min后过滤除去上清液，得白色沉淀提取物，用乙醇反复沉淀3次。

精制：往白色沉淀提取物中加入少量蒸馏水和1/10的活性炭，80℃加热溶解30 min，不断搅拌，趁热过滤。重复上面操作2次，合并滤液和洗液，加入95%乙醇重结晶，得到大蠊水提取物。参考并依据相关文献[6,7]对实验用的大蠊提取物的母液做了定量的含量测定试验和定性鉴别试验。在含量测定中，以大蠊提取物溶液中的酪氨酸作为测定对象，并以此通过转换计算总氨基酸的浓度。

1.2.2 动物分组及训练方案 SD大鼠适应性喂养2 d后，将40只大鼠随机分为安静组、运动组、美洲大蠊提取物+安静组、美洲大蠊提取物+运动组(n=10)。实验期间动物正常进食, 饮水。连续灌胃14 d，每天灌胃1次，对照组每次灌蒸馏水2 ml，服药组每天灌服2 ml美洲大蠊提取物 (美洲大蠊提取物按50 mg/kg配制,溶于2 ml蒸馏水中灌胃给药)。最后一次灌胃后1 h，运动组和美洲大蠊提取物PAE+运动组大鼠分别放入2个相同的恒温玻璃水槽(100 cm×60 cm×70 cm)中，水深为30 cm，水温维持在(31±1)℃，进行一次性力竭游泳试验，记录力竭游泳时间。力竭标准参照Thomas等[8]报道文献。标准为SD大鼠沉入水下超过10 s。

1.2.3 血清氧化应激指标测定 SD大鼠力竭运动后，立即经心脏抽取全血4 ml，并迅速取出心肌组织。室温静置30 min、5 000 r/min离心12 min，并取上清血清，采用ELSIA的方法检测血清中 SOD、MDA、GSH-Px指标。

1.2.4 心肌组织中一氧化氮合酶表达的检测 处死SD大鼠后，立即取出心脏在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸上拭干，并在冰上切成约100 mg 大小，用DEPC 水处理过的锡箔纸包裹，放入-70℃冰箱保存。用时取出，操作时避免RNA 酶污染。采用RT-PCR 方法对eNOS基因转录产物进行定性与半定量检测。制备含溴乙锭2%的琼脂糖凝胶, 取上述6 μl PCR 扩增产物进行含溴乙锭的琼脂糖凝胶(2%)电泳，用Bio-Rad 凝胶图像成像分析系统扫描结果，Quantity One 软件进行分析。

1.2.5 组织病理学观察 HE染色光镜观察大鼠心脏组织形态变化：每组随机选取3只大鼠的心脏、主动脉弓，取小块组织修整齐后置于中性福尔马林固定液中固定，72h后常规石蜡包埋切片(4 μm)。二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)各15 min，100%乙醇5 min，95%乙醇 5 min，80%的乙醇 5 min，75%的乙醇 5 min，蒸馏水洗 2 min，苏木素染色 5 min，水洗，1%盐酸酒精分化 30 s，氨水返蓝，置伊红染 15 min，水洗，80%的乙醇 5 min，95%的乙醇 5 min，100%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)各 5 min，二甲苯(Ⅰ)5 min，二甲苯(Ⅱ)5 min，中性树胶封片。光学显微镜下观察组织形态。

1.3 数据统计处理

2 结果

2.1 美洲大蠊提取物对SD大鼠力竭性游泳运动耐力的影响

与力竭组比较, 美洲大蠊提取物运动组能够显著提高SD大鼠的耐力(P<0.01，表1)。

GroupFrequencyActiontime(min) Resting1080.25±4.56PAE+resting1087.78±6.79Exhausted10118.45±8.76PAE+exhaus-ted10160.18±7.47**##

PAE： Periplaneta americana extract

**P<0.01vsresting group;##P<0.01vsexhausted group

2.2 美洲大蠊提取物对力竭性游泳运动后SD大鼠心血管氧化-抗氧化系统的影响

与安静组相比, 运动组一次力竭游泳后, 心肌SOD、GSH-Px 的活性明显降低(P<0.01，表2), 而MDA 含量显著升高(P<0.01，表2); 而美洲大蠊提取物能够显著提高力竭SD大鼠的心肌SOD、GSH-Px活性(P<0.01，表2), 降低MDA 含量(P<0.01，表2)。

GroupFrequencyMDA(ng/L)SOD(U/L)GSH-Px(U/L)Quiet1016.16±9.4030.20±2.67190.26±48.54Exhausted1024.49±7.38**19.40±4.44**159.85±50.59**PAE+Quiet1016.21±8.8529.59±45.82187.24±57.90PAE+Exhaus-ted1019.30±8.99##28.47±44.59##179.77±58.71##

MDA: Malondialdehyde； SOD： Superoxide dismutase； GSH-Px： Glutathione peroxidase； PAE： Periplaneta Americana extract

**P<0.01vsquiet group;##P<0.01vsexhausted group

2.3 美洲大蠊提取物对力竭游泳运动大鼠心肌组织eNOS表达的影响

RT-PCR半定量分析。美洲大蠊提取物作用后能够增加力竭运动大鼠心肌组织中eNOS基因转录水平的表达(图1)。安静组大鼠心肌组织中eNOS mRNA表达为0.7647±0.0387； PAE给予安静组后大鼠心肌组织中eNOS mRNA表达变较安静组比较不明显为0.7584±0.0124；力竭游泳运动大鼠心肌组织eNOSmRNA表达明显降低为0.1467±0.0263,较安静组和PAE+安静组相比差别显著性意义(P<0.05)；而PAE+力竭游泳运动大鼠心肌组织eNOS mRNA表达为0.687±0.0241，较力竭游泳运动组明显升高，具有显著性差异(P<0.05)。

2.4 美洲大蠊提取物对力竭游泳运动大鼠主动脉弓、心肌组织病变的影响

力竭游泳运动主动脉弓基本正常，局部可见粘液变性,心脏间质略显疏松水肿，可见较多脂肪组织。部分纤维间可见肌浆凝聚，但不明显。美洲大蠊提取物作用力竭运动主动脉弓基本正常，局部可见粘液变性，心脏组织也基本正常(图2，见彩图页Ⅰ)。

Fig. 1 Cardiac tissue eNOS mRNA expression levels in each group A: Quiet group； B: PAE+quiet group； C: PAE+exhausted group； D: Exhausted group； PAE： Periplaneta Americana extract

3 讨论

机体在正常状态下，存在完善的氧化-抗氧化的平衡体系[9,10]。内源性的抗氧化酶SOD可以有效清除氧自由基[11], 保护细胞免受氧化损伤，减少细胞毒性。多项研究报道[10]，当人体进行力竭运动后，机体负荷急剧增加, 机体耗氧量也急速升高，从而引起机体抗氧化酶系统活性的降低，氧自由基ROS大量产生，脂质过氧化产物MDA 生成增加。低浓度的ROS能够调节血管细胞的功能，但是大量的ROS产生，超过了机体抗氧化防御的能力，就会攻击细胞膜的多不饱和脂肪酸，启动脂质过氧化反应，改变细胞内蛋白质和酶的活性和功能，诱发心血管内皮细胞凋亡，导致整个机体的运动能力下降，进而造成力竭运动性心血管疾病的发生[12]。进一步的研究表明，给予抗氧化剂干预后，可以提高机体抗氧化酶的活性，清除大量自由基, 降低脂质过氧化反应, 从而延缓或消除运动性疲劳的产生[13-15]，提高运动机体的耐力。目前，通过从天然药物中探寻能够清除体内自由基的物质，利用这些物质与自由基结合，以阻断自由基对人体的攻击，将成为现代医药、保健业的热点[16,17]。美洲大蠊是传统的中药材，其全身不同部位分别含有丰富的多元醇、肽类及氨基酸等，对心血管疾病具有明显的疗效。本实验给予美洲大蠊提取物干预力竭运动大鼠后，通过观察其对SD大鼠力竭运动后心肌氧化应激损伤的各项指标的影响，来探讨美洲大蠊提取物抗运动性疲劳的机制。结果发现，在力竭运动过程中，美洲大蠊提取物通过提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低MDA 含量，同时又可刺激血管内皮氧化应激相关基因eNOS的表达，使心肌组织中脂质过氧化反应减少，从而细胞免受脂质过氧化的损伤，延长了大鼠力竭运动时间，提高机体运动能力，从而在保护心脏的过程中发挥作用，实现其抗运动性疲劳的目的。以美洲大蠊提取物作为研究目标，有望为日后揭示美洲大蠊提取物在力竭运动过程中保护机体免受过氧化损伤的机制提供理论依据。

[1] 胡艳芬， 吕小满， 王玉梅, 等. 美洲大蠊药用价值研究进展[J]. 医学综述， 2008， 14(18)： 2822-2824.

[2] Ravindran J, Gupta N, Agrawal M,etal. Modulation of ROS/MAPK signaling pathways by okadaic acid leads to cell death via, mitochondrial mediated caspase-dependent mechanism[J].Apoptosis, 2011, 16 (2): 145-161.

[3] Phaneuf S, Leeuwenburgh C. Apoptosis and exercise[J].MedSciSportsExerc, 2001, 7(3): 393-396.

[4] Kyto V, Lapatto R, Lakkisto P,etal. Glutathione depletion and cardiomyocyte apoptosis in viral myocarditis[J].EurJClinInvest, 2004, 34(3): 167-175.

[5] 黎昌莉. 美洲大蠊提取物诱导血管内皮细胞迁移的初步研究[D]. 重庆： 重庆大学， 2012： 9-10.

[6] 王玎玮， 李海波， 蒋学云， 等. 美洲大蠊药材中总氨基酸提取工艺优化研究[J]. 大理学院学报， 2008， 7(5): 3-5.

[7] 李海波， 蒋学云， 赵超仁， 等. 美洲大蠊药材质量控制方法的研究[J]. 大理学院学报， 2007， 6(8): 3-5.

[8] Thomas DP, Marshall KI. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures[J].IntJSportsMed, 1988, 9(4): 257-260.

[9] 杨小英， 张 钧， 刘华钢， 等. 牛磺酸复合液对大鼠抗运动疲劳能力的研究[J]. 体育科技， 2007, 28(1): 45-48.[10]卜于骏, 丁树哲. 耐力训练和一次性力竭运动对大鼠心肌和骨骼肌硫氧还蛋白还原酶的影响[J]. 中国运动医学杂志， 2005， 24(3): 293-296.

[11]Dekkers JC. The role of antioxidant vitamins and enzymes in the prevention of exercise induced muscle damage [J].SportsMed, 1996, 21(3): 213-238.

[12]杨海平， 王江民， 肖 琳， 等. 低氧、力竭运动对大鼠骨骼肌SOD、MDA及线粒体钙的影响[J]. 山东体育学院学报， 2009, 25(5): 24-28.

[13]Minato K, Miyake Y, Fukumoto S.etal. Lemon flavonoid, eriocitrin,suppresses exercise-inducedoxidative damage in rat liver[J].LifeSci, 2003, 72(14): 1609-1616.

[14]庞 伟， 蒋与刚， 杨红澎， 等. 蓝莓提取物对H2O2诱导的体外培养的大鼠海马神经元氧化损伤的保护作用[J]. 中国应用生理学杂志， 2010, 26(1)： 51-54.

[15]黎明华, 汤长发， 欧阳江琼， 等. 红景天苷对运动后自由基和能量代谢改变的影响[J]. 中国应用生理学杂志， 2012, 28(1)： 53.

[16]陈彦球， 杨 琦， 杨 燕， 等. 维生素C在低密度脂蛋白氧化修饰中作用的体外实验[J]. 中华预防医学杂志, 2002, 36 (1)： 25-29.

[17]胡春生， 胡怡秀， 胡余明， 等. 北京蜂胶对老龄小鼠抗氧化功能影响的实验研究[J]. 实用预防医学， 2005， 12(5)： 1203-1204.

中央高校基本科研业务费资助项目(CQDXWL-2012-106)

2015-01-07 【修回日期】2015-03-02

R804.2

A

1000-6834(2015)05-404-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.006

△【通讯作者】Tel: 13708330018; E-mail: majun@cqu.edu,cn