转人P301L突变tau基因小鼠学习记忆功能与与脑内NO的改变*

高婧玮， 虞立霞， 洪 燕△， 牛 超， 陈 媛， 汪雪兰， 陈汝筑△， 汪 海△

(1. 中山大学中山医学院， 广东 广州 518000； 2. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050)



转人P301L突变tau基因小鼠学习记忆功能与与脑内NO的改变*

高婧玮1， 虞立霞2， 洪 燕2△， 牛 超2， 陈 媛2， 汪雪兰1， 陈汝筑1△， 汪 海2△

(1. 中山大学中山医学院， 广东 广州 518000； 2. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050)

目的：探究第十代转人P301L突变tau基因小鼠(F10)学习记忆障碍的机制。方法：Western blot法检测F10代小鼠人tau蛋白的表达与tau蛋白磷酸化水平的改变；Bielshowsky法银染脑片显示神经纤维缠结；旷场实验与避暗实验检测小鼠学习记忆能力的改变。比色法检测小鼠全脑乙酰胆碱水平，胆碱乙酰转移酶活性与胆碱酯酶活性变化；硝酸还原酶法检测小鼠全脑一氧化氮水平的改变。结果：转人P301L突变tau基因小鼠可表达外源人tau蛋白，3月龄小鼠大脑皮层和海马中出现tau蛋白磷酸化水平明显升高及7月龄小鼠皮层形成神经纤维缠结和出现学习记忆障碍；转人P301L突变tau基因小鼠全脑乙酰胆碱水平，胆碱酯酶活性和胆碱乙酰转移酶活性及表达均未见明显改变；但该小鼠全脑一氧化氮水平却明显下降。结论：F10代转人P301L突变tau基因小鼠仍可遗传亲本性状，7月龄小鼠同时出现学习记忆障碍与全脑一氧化氮含量明显下降的现象，提示转人P301L突变tau基因小鼠全脑一氧化氮含量下降可能涉及其学习记忆障碍机制。

tau基因；P301L突变；转人tau基因小鼠；脑；一氧化氮；胆碱能系统

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 是一

种临床上以学习障碍与认知障碍为主的神经退行性疾病。其发病机制涉及多种遗传与环境因素的相互作用，构建模拟AD发病机制的理想动物模型对于AD研究的开展提有重要意义。在用于研究AD发病机理的不同动物模型中，转基因动物模型可以模拟人AD主要病理以及生物行为学变化[1]，其中表达P301L突变的转人tau基因小鼠可稳定在子代脑中各区表达人异常tau蛋白，并出现tau蛋白异常磷酸化及神经纤维缠结等AD病理特征，以及可较早发生学习记忆认知障碍，是用于AD研究较理想的模型[2]，但目前有关在该动物模型上探讨学习记忆认知障碍机制的报道较少。本研究以本实验室前期建立并已传10代的转人P301L突变tau基因小鼠(F10)[3](以下简称为转人tau基因小鼠)为动物模型，研究其学习记忆认知障碍的机制。本实验检测了转人tau基因小鼠脑内乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)水平、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)活性以及胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase, ChAT)活性的改变，并对转人tau基因小鼠脑内一氧化氮(nitric oxide, NO)含量的改变进行了研究。转人tau基因小鼠脑内NO含量的改变，旨在探究NO与tau蛋白病变以及AD疾病之间的关系，以为该领域的研究提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

转人P301L突变tau基因阳性小鼠由本实验室建立模型小鼠传代至10代(F10)所得[3]，野生型C57小鼠由军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物中心提供。动物饲养在SPF级动物房，自由进食饮水，通过操作动物房灯光开关时间使其昼夜节律按12 h∶12 h的规律进行。

1.2 药品与试剂

识别总tau蛋白的tau-46抗体购自Cell-Signal公司、单克隆抗体AT180/AT8购自Thermo公司，单克隆抗体S396以及相应二抗购自Abcam公司，特异性识别人tau蛋白的单克隆抗体tau-13购自Santa-Cruz公司，用于内参的β-tubulin抗体购于Abbkine

Western blot超敏ECL化学发光底物为武汉博士得生物工程有限公司产品； ChAT测试试剂盒、TChE测定试剂盒、ACh测定试剂盒、NO测试试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 Western blot法测定转基因小鼠脑内人tau蛋白表达，磷酸化tau蛋白以及胆碱乙酰转移酶表达

上述3项指标实验分别进行3次重复，实验时取7月龄转基因小鼠及野生型C57小鼠各3只(tau蛋白磷酸化实验另取3月龄小鼠各3只)，取大脑并分离大脑皮层和海马，按王艳艳[3]等报道用Western blot法检测小鼠大脑皮层和海马组织的人tau蛋白表达，tau蛋白磷酸化水平以及胆碱乙酰转移酶表达。

1.4 Bielschowsky银染法光学显微镜镜检转基因小鼠脑内神经纤维缠结

取3月龄、7月龄转基因小鼠及野生型C57小鼠各3只，取脑并制成脑片。按以往研究报道[3,4]用Bielschowsky银染法光学显微镜高倍镜检小鼠大脑皮层神经纤维缠结。

1.5 旷场实验观察一般行为学改变

野生型C57小鼠18只为对照组，转基因小鼠24只为实验组。将小鼠置于实验箱中央格正中央，以5 min内动物穿格次数、竖立次数、首次跨出中央格所需时间(潜伏期)、修饰次数和排泄次数为观察指标。

1.6 避暗实验观察学习记忆能力改变

野生型C57小鼠21只为对照组，转基因小鼠27只为实验组。第1天训练以适应环境；第2天避暗箱通电，将动物放入后受电击即拿出；第3天为正式实验，将避暗箱通电，把小鼠放入明室后，记录5 min内动物进入暗室的次数(错误次数)以及第1次进入暗室所需时间(潜伏期)。

1.7 比色法检测ACh含量，AChE活性以及ChAT活性改变

以野生型C57小鼠为对照组，转人tau基因小鼠为实验组。按试剂盒提供步骤操作。其中ACh含量检测对照组及实验组各8只；AChE活性检测实验组9只，对照组10只；ChAT活性检测实验组13只，对照组14只。

1.8 硝酸还原法检测NO含量

野生型C57小鼠17只为对照组，转基因小鼠17只为实验组。按试剂盒提供步骤操作。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 转人P301L突变tau基因小鼠脑内人tau蛋白表达和tau蛋白磷酸化水平的改变

Western blot结果显示：转人tau基因小鼠海马和大脑皮层均有人tau蛋白的高表达，而野生型C57小鼠未见人tau蛋白条带(图1)。说明转人tau基因小鼠模型中，转入的人突变tau基因在海马和大脑皮层中有稳定表达。

在3月龄转人tau基因小鼠的大脑皮层中AT8、AT180和S396识别位点的磷酸化tau蛋白水平均较3月龄野生型C57小鼠分别增加了247%，27%和220%(P<0.05，n=3)；7月龄转人tau基因小鼠的大脑皮层中，S396识别位点磷酸化tau蛋白水平增加了126%(P<0.05，n=3)， AT180和AT8识别位点tau蛋白磷酸化水平与7月龄野生型C57小鼠无显著差异。3月龄和7月龄转人tau基因小鼠和同月龄野生型C57小鼠大脑皮层组织中由tau46识别的总tau蛋白水平未发现显著差异。

Fig. 1 Expression of human tau protein in hippocampus and cerebrocortex in the 7-month transgenic mice(n=3) hip：Hippocampus; cor：Cortex； 1,2： Tau transgenic mice； 3,4： Wild type mice

2.2 光学显微镜检查转人P301L突变tau基因小鼠脑内神经纤维缠结

Bielschowsky银染法染色脑片经光学显微镜高倍镜检结果显示：在7月龄转人tau基因小鼠的皮层可观察到火焰状或球形的神经纤维缠结，7月龄野生型C57小鼠，3月龄转人tau基因小鼠和3月龄野生型C57小鼠皮层未观察到出现神经纤维缠结(图2)。

Fig. 2 Observation of neurofibrillary tangles in cerebrocortex in the transgenic mice by microscope with Bielshowsky silver staining method(Bielschowsky ×400) a： 7-month transgenic mice； b： 7-month wild type C57 mice; Tg: Transgenic mice; Wt: Wild type mice

2.3 行为学实验结果

在行为学实验过程中，为使数据达到统计条件，需要较大样本量，由于相应月龄阴性小鼠数量较少，且有部分样本用于其他实验，故两次实验样本量未进行统一。旷场实验结果显示：转人tau基因小鼠的潜伏期(中位数7.5，四分位数间距为5.5～14.5，n=24，单位：s)显著高于野生型C57小鼠(中位数3，四分位数间距为2～7，n=18，单位：s)，有统计学差异(P<0.01)，其他行为学观测指标无显著性差异。避暗实验实验结果显示：7月龄野生型C57小鼠潜伏期中位数为45，四分位数间距为22～300(s)，错误次数平均数为4.8(n=21)，同月龄转人tau基因小鼠的潜伏期中位数为18，四分位数间距为13～46(s)，错误次数平均数为9.0(n=27)，其潜伏期明显缩短(P<0.05)，错误次数显著增加(P<0.05)，提示7月龄转人tau基因小鼠出现学习记忆认知能力显著下降。

2.4 转人tau基因小鼠全脑Ach含量、AChE和ChAT活性与ChAT表达的检测

按试剂盒步骤采用比色法检测7月龄转人tau基因小鼠(Tg)与7月龄野生型C57小鼠(Wt)全脑ACh含量、AChE活性以及ChAT活性。结果显示转人tau基因小鼠与野生型C57小鼠之间三个指标均无显著性差异(表1)。Western blot法检测转人tau基因小鼠与野生型C57小鼠大脑皮层及海马ChAT表达量，检测结果显示转人tau基因小鼠与野生型C57小鼠大脑皮层ChAT表达量分别为0.71+0.14和0.57+0.10，转人tau基因小鼠与野生型C57小鼠海马ChAT表达量分别为0.70+0.14和0.66+0.06，两者不存在显著性差异(图3)。

GroupnAch(μg/mg·prot)nAChE(U/mg·prot)nChAT(U/g)Tg811.11±3.0390.151±0.04213128.95±84.59Wt810.42±2.49100.165±0.04714138.99±86.36

Tg： Transgenic mice； Wt： Wild type mice； Ach： Acetylcholinesterase； AchE： Acetylcholinesteras； ChAT： Cholineacetyltransferase

2.5 7月龄转人tau基因小鼠全脑NO含量检测

用硝酸还原酶法检测7月龄转人tau基因小鼠和7月龄野生型C57小鼠，结果表明全脑NO含量分别为(1.97+1.83)μmol/mg·prot和(3.61+2.46)μmol/mg·prot，可见7月龄转人tau基因小鼠全脑NO含量明显低于野生型C57小鼠，减少45%(P<0.05，图4)。

3 讨论

在本实验室前期通过雄原核显微注射法，将带有小鼠特异性神经元启动子Thy-1的表达P301L突变的最长人tau异构体htau40注射进入受精卵中，再将注射后的受精卵移入假孕母鼠的输卵管内继续发育，最终获得转人P301L突变tau基因小鼠。经实验，检测到转人tau基因小鼠脑内不同脑区均存在外源人tau基因的表达，并出现异常tau蛋白磷酸化，以及神经纤维缠结和学习记忆障碍的现象[3]，与外Khler C[2]等报道的转人P301L突变tau基因小鼠生物遗传学、行为学特征十分相似。本实验检测到7月龄第10代转人tau基因小鼠的海马与大脑皮层存在外源人tau蛋白的表达以及神经纤维缠结的形成，以及 3月龄和7月龄转人tau基因小鼠大脑皮层组织中tau蛋白磷酸化水平的显著升高。旷场实验与避暗实验结果表明， 7月龄转人tau基因小鼠环境存在认知能力和学习记忆能力障碍。综合上述结果，说明本实验室建立的转人tau基因小鼠在传代至第10代时仍可稳定遗传其亲本生物学行为学及病理学特性。

众所周知，脑内胆碱能系统在学习记忆认知中发挥重要的作用。本实验通过比色法检测了7月龄转人tau基因小鼠与野生型C57小鼠全脑组织ACh含量、ChAT活性以及AChE活性，并通过免疫印迹分析检测了转人tau基因小鼠海马和大脑皮层组织内ChAT的表达等胆碱能系统相关指标。但并未观察到转人tau基因小鼠与野生型C57小鼠两者在以上指标之间存在显著差异。该结果与Morcinek等人的研究结果相似[2,5]。但近年来也有大量在转人tau基因小鼠脑内检测到胆碱能系统相关指标改变的报道。Silveyral等[6]在VLW小鼠的海马、皮层和小脑均检测到AChE活性，AChE蛋白表达和mRNA水平的显著升高。Stein等[7]采用微透析-高效液相色谱法检测发现表达P301L突变的转tau基因小鼠脑内ACh的含量有显著增高。本研究结果与上述报道的差异一方面可能由于转入基因的不同造成，另一方面由于本文实验方法的受限，无法达到上述文献报道检测的灵敏度，同时本实验未能细分检测脑区，也可能掩盖了检测指标的改变。

在以往针对转人tau基因动物模型的研究中，胆碱能系统受到广泛研究[2，5-7]。本实验虽未能检测到胆碱能系统指标的改变，但对经典神经递质NO进行了探究。NO作为一种逆向神经信息传递物质，参与脑内信息传递，受到广泛关注[8]。NO可加强动物学习记忆能力。Son等[9]在敲除nNOS和eNOS双基因小鼠发现，小鼠海马长时程强(LTP)出现明显下降。Rickard等[10]较早报道，在雏鸡一次性被动避行为模型，注射L-精氨酸可加强雏鸡长时程记忆，给予NOS抑制剂L-硝基--精氨酸(L-NNA)则抑制雏鸡记忆，导致遗忘。NO与AD之间的关系也正在逐渐引起关注[11]。近年有报道[12]，给老年痴呆患者口服L-精氨酸，可观察到患者面部表情及反应能力有一定程度改善。但在对转人tau基因小鼠的研究中，针对NO以及相关酶活性的研究尚未见报道。本实验在国内外研究中首次对转人tau基因小鼠的脑内NO含量进行了检测，并检测到7月龄转人tau基因小鼠全脑NO含量较野生型C57小鼠相比降低了45%。在本实验室前期研究中，用ACh处理野生型C57小鼠腹主动脉血管可引发 M受体介导的依赖内皮的血管舒张反应，但同样用ACh处理5月龄、7月龄转人tau基因小鼠腹主动脉血管，却未能引发M受体介导的依赖内皮的血管舒张反应；若先给予NO前体L-精氨酸处理，ACh仍不能引发转人tau基因小鼠的血管舒张反应，提示转人tau基因小鼠的血管内皮细胞内L-精氨酸-NO合成途径可能受到阻断，导致ACh不能引发转tau基因小鼠血管舒张反应(结果另文发表)。结合7月龄转人tau基因小鼠全脑NO的显著降低的实验结果，提示转人tau基因小鼠脑组织的NO合成可能受到影响。该实验结果引发了NO在tau蛋白病变以及AD发病机制中可能作用的思考。在以往的研究中，NO主要作为引起炎症的主要物质及氧化应激的产物，而对tau蛋白病变的作用及在转人tau基因小鼠模型中探讨NO与其学习记忆功能障碍的关系鲜有研究。本实验在检测到7月龄转人tau基因小鼠出现全脑NO显著降低的同时亦检测到同月龄转人tau基因小鼠出现显著的学习记忆行为障碍，因此有理由推测转人tau基因小鼠全脑NO含量的降低有可能与其学习记忆障碍相关。有关脑内NO含量的降低引发转人tau基因小鼠学习记忆障碍的机制尚待进一步研究探讨。

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Change of memory function and decrease of nitric oxide level of whole brain in the transgenic mice expressing human tau 40 with P301L mutation

GAO Jing-wei1, YU Li-xia2, HONG Yan2△, NIU Chao2, CHEN Yuan2, WANG Xue-lan1, CHEN Ru-zhu1△, WANG Hai2△

(1. Zhongshan Medical College, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080; 2. Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, China)

Objective: To study the mechanism of learning and memory dysfuction in the transgenic mouse expressing human tau 40 isoform with P301L mutation (F10). Methods: The human tau protein expression and phosphor-tau protein levels were detected with Western blot method. The neurofibrillary tangles were observed with Bielshowsky silver stain. The behavior changes of learning and memory were observed by open field test and passive avoidance test. Acetylcholine level, activities of acetycholinesterase and choline acetyltransferase of whole brain was detected by colorimetry method.The nitric oxide level of whole brain was detected by nitrate enzyme reduction method. Results: Exogenous human tau gene was expressed and an elevation of phosphor-tau protein level in 7 and 3-month transgenic mice’s hippocampus andcerebrocortex was observed. The neurofibrillary tangles were observed in cerebrocortex of 7-month transgenic mice; the 7-month transgenic mice also presented an evident reduction of learning and memory ability and nitric oxide level of the whole brain, but not changes in acetylcholine level, acetycholinesterase activity, choline acetyltransferase activity and expression in whole brain. Conclusion: Tau transgenic mice (F10) can still inherit their parents’ biologiccal characters, and develop learning and memory dysfunction awnodh san obvious decrease in nitric oxide level of whole brain in the 7-month old mice, suggesting a decrease of nitric oxide level of whole brain would be involved in the mechanism of learning and memory dysfunction in these transgenic mice.

tau gen; P301L mutation; tau transgenic mouse; brain nitric oxide; cholinergic system

天津市应用基础与前沿技术研究计划(C13JCZDJC 30400)

2014-12-25 【修回日期】2015-03-02

R338；R749.1

A

1000-6834(2015)05-385-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.001

△【通讯作者】Tel： 020-87330561, 022-84655056, 010-66935601; E-mail: crz@mail.sysu.edu.cn, wh9588@yahoo.com.cn, yhong60@hotmail.com