人乳头瘤病毒16型E5蛋白的生物学活性研究进展

杨慧伦综述 张宗峰审校

综 述

人乳头瘤病毒16型E5蛋白的生物学活性研究进展

杨慧伦综述 张宗峰审校

人乳头瘤病毒16型；E5蛋白；生物学活性；宫颈癌

宫颈癌发病率位于女性肿瘤的第3位，全球每年有约27万女性死于宫颈癌[1]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)持续感染是宫颈癌的主要危险因素，90%以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染。HPV是一种乳头瘤空泡病毒，为球形DNA病毒，能引起皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前已分离出130多种HPV，根据其致癌危险性不同可分为低危型(low-risk human papilloma virus, LR-HPV)和高危型(high-risk human papilloma virus, HR-HPV)两大类。其中，HR-HPV除可引起生殖器疣病外，更重要的是还可引起外生殖器癌、高度宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)和子宫颈癌[2]，较常见的是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35等，而又以HPV16最普遍, 部分地区宫颈癌组织中HPV16检出率可高达77．6%～82．6%。HPV16感染宫颈上皮基底层细胞后病毒基因组复制，并以游离体形式引发宫颈上皮内瘤变，然后以结合体形式整合到宫颈上皮细胞基因组中，进而使原癌基因过度表达、抑癌基因失活，最终导致宫颈细胞癌变。HPV16基因可编码9个开放阅读框架，根据其功能不同可分为：早期区(E)、晚期区(L)和非编码区(NCR)，其中早期区(E)共编码E1-E7共7个蛋白，它们共同参与病毒复制、转录、翻译及细胞转化等[3]。对E6和E7蛋白的致癌作用已有较深入的研究，它们分别与p53和Rb蛋白结合使其降解，导致细胞周期失调、无限增殖而呈永生化，最终形成肿瘤[4]。然而对E5蛋白的致癌作用研究相对较少。本文将结合最近研究对E5蛋白的生物学活性进行综述如下。

1 HPV16 E5蛋白的生物学活性

HPV16 E5蛋白是由83个氨基酸组成的一种较小的疏水膜蛋白，处于E2开放阅读框架下游。HPV16型E5蛋白有广泛的序列相似性和共同的特征，即都有较高疏水性的氨基端和亲水性的羧基端。其中，氨基端疏水结构域与其在细胞膜的插入位置有关，它通过与表皮生长因子受体(EGFR)、血小板生长因子受体等相互作用，引起病毒生物学活性改变。将羧基端部分注射至休止细胞，能够诱导细胞DNA 合成，尤其是羧基端的2个半胱氨酸(Cys)残基，能明显诱导细胞DNA合成，这说明亲水羧基端是E5产生细胞转化所必需的部分[5]。在转化细胞中，E5形成同源二聚体后主要位于内质网和高尔基体，少量分布于细胞质膜。

Liao等[6]通过免疫组化法对宫颈病变组织标本进行检测，发现E5蛋白在CIN I、CIN II、CIN III和宫颈鳞状细胞癌中表达率分别为93.33%、86.96%、66.66%和12.00%，提示在宫颈病变早期存在丰富的E5蛋白表达，但并不是所有的宫颈病变都存在E5蛋白的过表达, 表明它不是形成恶性肿瘤必要条件。在HPV16感染的宫颈病变早期，E5蛋白mRNA含量较高，而到宫颈病变晚期常因HPV整合入宿主细胞基因组而使E5蛋白表达缺失，这表明E5蛋白可能在宫颈癌发病早期有一定作用。Maufort等[7]建立了高危型HPV16蛋白转基因小鼠模型，定量检测上皮细胞永生化水平，证实有E5协同作用时，细胞的永生化能力提高了4～10倍，肿瘤的进展明显；而单独用E5蛋白基因转染小鼠时，延长其作用时间，也能够发生癌变，提示E5蛋白存在一定的致癌作用。

2 HPV16 E5蛋白的机制作用

2.1 E5蛋白激活EGFR信号通路 EGFR在多种良、恶性肿瘤中存在过度表达，其过表达与肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关，应用EGFR抑制剂可明显抑制肿瘤生长。研究证实，E5蛋白能够以配体依赖的形式激活EGFR信号通路，刺激细胞的增殖及分化，增加肿瘤发生的风险[8]。在上皮细胞中稳定转染E5蛋白并用EGF处理，发现EGFR磷酸化明显增强，然而EGFR的数量并不是在所有细胞中均增加。用结合有对pH敏感荧光剂的EGF处理细胞并进行追踪，发现EGFR磷酸化增强的主要机制是抑制胞内体融合进而抑制其酸化。此外，转染人上皮细胞还发现, E5蛋白能够绑定V-ATP酶16kD的c亚基，抑制V-ATP酶的酸化作用，为胞内创造碱性环境并激活EGFR。

最新研究表明，E5蛋白还能以非配体依赖的形式激活EGFR，活化丝裂原活化蛋白激酶—胞外信号调节激酶(MAPK-ERK1/2)。MAPK的激活主要通过2种途径：(1)为激活酪氨酸激酶调节受体途径；(2)为蛋白激酶C(PKC)依赖途径。ERK1/2的激活主要通过山梨醇依赖途径，用山梨醇糖处理E5蛋白转染的细胞，使其形成一种高渗透压冲击波，发现ERK1/2途径被激活，该作用仅部分被特异性EGFR抑制剂AG1478抑制，间接证明了E5蛋白在对EGFR的激活途径存在非配体依赖途径[8]。

c-Cbl(c-Casitas B-lineage lymphoma)基因编码的c-Cbl蛋白在细胞增殖分化中具有重要作用，c-Cbl基因突变可影响信号转导通路。实验发现在E5蛋白转染的细胞中，c-Cbl的下降水平与EGFR及其泛素化升高水平成正比，提示E5蛋白可能通过抑制c-Cbl减少EGFR的降解，从而促进EGFR介导的信号转导，促进细胞增殖作用。E5蛋白还可以通过其羧基末端介导胞内核小体碱化, 延缓EGFR的降解而增加细胞表面受体循环量和活性。

E5蛋白除了能激活EGFR外，对Erb家族其他成员也有一定影响。实验证明，在E5蛋白转染的细胞中，Erb2、Erb4的活性存在不同程度的改变，但具体机制不详。此外E5蛋白对与G蛋白耦联的内皮素受体(ET-A)通路也有一定干预，在缺乏生长因子的角质细胞中，E5蛋白的出现能明显增强ET的作用，进而刺激细胞有丝分裂，导致细胞大量增殖、分化，增加肿瘤发生的风险。

CD1d和CD1d限制性自然杀伤T细胞是先天性免疫和适应性免疫反应之间的桥梁，许多病毒能下调CD1d水平而使感染的宿主细胞能逃避免疫监视。大量体内外实验证实，在HPV阴性的上皮组织中CD1d的免疫活性明显较强，而在HPV16阳性的CIN上皮组织中明显减弱。在HPV阴性的宫颈癌C-33A细胞系中建立CD1d的免疫模型后转染E5蛋白，发现CD1d水平下降，应用共聚焦显微镜观察发现在内质网中E5蛋白能够与调节CD1d的钙连蛋白结合，使其积聚于内质网内，使病毒感染的细胞逃避宿主的免疫监视及免疫清除作用[13]。

2.3 E5蛋白对炎细胞通路的激活 环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)在CIN及宫颈癌中均存在过度表达。研究表明，COX-2宫颈癌淋巴转移密切相关，应用COX-2抑制剂可明显抑制肿瘤的生长及转移，提示COX-2可能与宫颈癌预后及治疗方案的制定有指导意义[17]。HPV16 E6、E7能增强COX-2启动子中AP-1活化蛋白对环磷酸腺苷反应因子(cAMP reaction element, CRE)的绑定作用，使COX-2的过度表达。研究证实，E5蛋白对于COX-2的表达也有一定作用，E5蛋白能激活EGFR通路，增强NF-κB和AP-1的绑定作用，从而上调COX-2的表达水平，不同于E6、E7的是，E5蛋白调节COX-2是通过NF-κB发挥作用的。

前列腺素E2(PGE2)是COX-2的主要产物，其表达水平与多种肿瘤恶性程度呈正相关，可影响细胞增殖分化、血管生成及肿瘤细胞迁移和扩散等。PGE2的受体在肿瘤组织中存在异常表达，该受体有4种亚型(EP14)，不同亚型与配体结合的亲和力不同而在下游信号转导通路中产生不同效应，其中EP-4受体在乳腺及肠道肿瘤中已被证实与肿瘤进展相关。实验证实，E5蛋白通过COX-2的过度表达来促进PGE2的分泌。PGE2的激活加强了环磷酸腺苷反应因子结合蛋白对CRE的绑定作用，进而激活EP-4受体基因的启动子，促进EP-4受体的表达。此外，E5蛋白还可以通过激活EGFR来上调EP-4的水平。应用AG1478(EGFR抑制剂)和NS-398(COX-2抑制剂)分别处理宫颈癌C-33A细胞，发现EP-4水平下降，证实E5蛋白对EP-4受体的激活作用与EGFR和COX-2信号通路有关。

2.4 E5蛋白对血管内皮生成因子的上调作用 血管内皮生长因子(VEGF)家族的不同成员对肿瘤的生长及转移有重要影响，其过表达直接导致肿瘤细胞的扩散和转移。研究表明，VEGF蛋白表达与宫颈癌淋巴转移和脉管转移明显相关[17]。HPV16型E6、E7已被证实通过HIF-1α依赖途径激活VEGF。研究证实，E5蛋白对于VEGF也有一定影响。在HEK293、HaCaT 和HT-3 等多种宫颈癌细胞系中转染E5蛋白，发现各细胞系中均存在VEGF过表达，提示E5蛋白对于VEGF上调作用存在普遍性。为进一步研究E5蛋白对VEGF的调节机制，分别用EGFR、MEK-ERK1/2及PI3K/Akt抑制剂处理细胞，结果发现VEGF启动子的活性受到抑制，其表达也明显降低，提示E5蛋白对VEGF的上调作用与EGFR、ERK1/2及PI3K-Akt传导途径的激活有关。

2.5 E5蛋白的抗凋亡作用 研究表明，E5蛋白能够通过多种途径抑制细胞凋亡[18]，延长细胞寿命致其永生化，使已经发生癌变的及有明显癌变倾向的细胞寿命延长、堆积，从而形成癌性肿块。B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)是细胞凋亡中最重要的癌基因之一，其前体蛋白Bax、Bak的下调能抑制细胞凋亡。在人宫颈癌C-33A细胞中稳定转染E5蛋白能激活泛素蛋白酶体通路，从而缩短Bax的半衰期，使Bax表达明显降低。进一步研究发现，Bax的mRNA含量并无明显改变，提示E5蛋白主要是从翻译水平下调Bax含量，从而抑制细胞凋亡[19]。E5蛋白还可通过抑制细胞凋亡蛋白酶-3(CAS-3)及细胞色素c(cyt-c)释放入胞液，来抑制过氧化氢(H2O2)介导的细胞凋亡。

Fas及其配体FasL是细胞凋亡的膜表面分子，其水平下降导致细胞凋亡程序的阻断。在HaCaT 细胞中转染E5蛋白，应用早、晚期监测半胱氨酸蛋白酶-3的裂解和DNA片段法对细胞凋亡进行评价，发现Fas表达减少，证实E5蛋白能够削弱降低Fas-FasL之间作用及肿瘤促凋亡因子配体(TRAIL)数量，抑制细胞凋亡。此外，E5蛋白还能激活PI3K和ERK1/2途径，使细胞免于受到紫外线等物理刺激所引发的凋亡。

2.6 E5蛋白对抑癌基因的抑制作用 P21和P27是2种细胞周期蛋白激酶抑制物(cyclin-dependent protein kinases inhibiter, CKI)，E5蛋白对它们有抑制作用。E5蛋白可在转录水平抑制p21的表达，使p21启动子处于失活状态，使细胞永生化。E5蛋白能缩短p27 Kip1的半衰期，加速p27 Kip1的降解，使细胞进入S期，逃避细胞凋亡而呈永生化。此外，HPV16 E5蛋白还能影响原癌基因c-jun的活性，在转录水平影响p21Wafl/Sdil/Cipl的表达，导致细胞周期调控失调，细胞永生化[20]。研究显示，E5蛋白与EGF同时存在时，对p27 Kip1抑制作用更加明显，而当存在EGFR抑制剂作用时，这种抑制效应则消失，提示E5蛋白对抑癌基因的抑制作用可能与EGFR信号通路有关。

2.7 E5蛋白对细胞核形态及大小的影响 Hu等[21]在HaCaT上皮细胞中稳定转染E5蛋白并在显微镜下动态监测细胞分裂及体积变化，发现E5高表达的细胞存在细胞核增大及有丝分裂速度加快等现象。对核消除至细胞分裂间期进行监控，发现细胞核体积改变与有丝分裂进程无关，且细胞融合后核质并未融合，提示E5高表达导致的核增大与细胞间融合无关。进一步研究发现，用羟基脲培养细胞来抑制DNA的合成可使核增大的现象消失，证实E5蛋白高表达主要是通过核内复制来增大细胞核体积。此外，最新研究表明HPV16 E5蛋白表达是双核细胞形成的必要和充分条件[22]。尽管E5蛋白诱导的大多数双核细胞不能繁殖，但共表达E6和E7基因可促进这些细胞繁殖，进而增加双核细胞的形成率。此过程可能使细胞基因组不稳定，导致细胞不断增殖而形成肿瘤。

2.8 E5蛋白对上皮间质化的作用 上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是细胞上皮细胞极性丧失和间质细胞特性获得为表现，伴随多个分子标志物改变，例如上皮细胞标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)等表达下调及间质细胞标志物Vim-1、Snail及Twist等表达上调，与肿瘤的浸润、转移密切相关。实验证实，HPV16癌蛋白能和成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF)协同作用，抑制E-cadherin及激活Vim-1来促进EMT，进而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[23]。在此基础上，Rehana对E5蛋白进行检测，发现HPV16 E5蛋白能使成纤维生长因子受体2b(fibroblast growth factor recepter 2b, FGFR2b)转换为FGFR2c，这种转变所导致细胞应答及配体特异性改变促进上皮细胞失去上皮表型，获得降解细胞外基质能力等间质表型[24]，使肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力。

3 小 结

尽管HPV16型E5蛋白很多的致病机制尚不明确，但不可否认的是，它作为一种病毒致病基因在宫颈癌早期病变中发挥一定作用。HPV16 E5蛋白除了能激活相关信号通路及抑制免疫反应外，还能对肿瘤血管、上皮间充质化、细胞凋亡及细胞核形态等多方面发挥显著作用。未来，针对HPV16 E5蛋白的深入研究可能为宫颈癌早期防治及靶向治疗的提供重要理论依据，具有广阔的临床应用前景。

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黑龙江省自然科学基金面上项目(No.200906)；黑龙江省卫生厅科研课题(No.2009-112)；哈尔滨医科大学附属二院 博士科研基金项目(No.BS2009-15)

150001 哈尔滨医科大学附属二院妇科肿瘤科

张宗峰，E-mail：viaac1973@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.029

2015-01-08)