日本血吸虫P7蛋白基因免疫诊断价值的初步研究*

刘晓静 汪学龙

(1.皖西卫生职业学院，安徽 六安 237000； 2.安徽医科大学基础医学院，安徽 合肥 230032)

日本血吸虫P7蛋白基因免疫诊断价值的初步研究*

刘晓静1汪学龙2

(1.皖西卫生职业学院，安徽 六安 237000； 2.安徽医科大学基础医学院，安徽 合肥 230032)

目的 为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子，在大肠杆菌中克隆、表达日本血吸虫(SjP7)蛋白，建立纯化重组抗原间接ELISA方法(rSjP7-ELISA)诊断日本血吸虫病。方法 设计引物，用PCR法扩增出日本血吸虫 P7样蛋白基因编码基因序列，T载体连接，再将其亚克隆入pET28a(+)表达载体中，经酶切、测序证实正确后，用IPTG对该重组菌诱导表达，SDS-PAGE和Western blot验证表达量和免疫活性。结果 PCR法扩增出一条大小约为423 bp大小的SjP7样蛋白的DNA片断，将其克隆亚表达质粒pET28a(+)，测序证实具有完整的ORF。结论 日本血吸虫P7蛋白在血吸虫病免疫诊断上具有较大的应用潜能。

日本血吸虫；SjP7蛋白；克隆；免疫诊断

血吸虫病(schitosomiasis)流行于全世界76个国家和地区。目前估计流行区约6亿人口受威胁，感染人口近2亿[1-3]。日本血吸虫主要分布在中国、日本、菲律宾及印度尼西亚等西太平洋地区的一些国家。在我国仅只有日本血吸虫流行，在我国长江流域和长江以南十三个省、直辖市、自治区曾经流行严重。日本血吸虫病是由于日本血吸虫成虫寄生在人或脊椎动物肠系膜静脉中，所引起的一种人兽共患寄生虫病，其主要的病理特征为虫卵肉芽肿导致的肝纤维化。目前，我国仍有90多个县(市)存在血吸虫病流行，有36万血吸虫病人；存在钉螺的总面积多达35亿m2；且每年都有新病例发生[4-7]。其中早期、准确地诊断是重要一环，故研制特异性高、敏感性强、可以判断现症感染和疗效的标准化诊断试剂，仍是当前血吸虫病研究的重要内容。本研究将SjP7基因亚克隆至pET-28a(+)原核表达载体，诱导表达并纯化重组SjP7蛋白，用其作为抗原间接ELISA法免疫诊断血吸虫病，初步探讨其在血吸虫病诊断中的使用价值。

1 材料与方法

1.1 文库、菌株和质粒 日本血吸虫成虫cDNA文库，大肠杆菌DH5α，BL21菌，pET28a(+)表达载体由本实验室保存。

1.2 实验试剂及来源 ① 氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG、Tris碱、TaqDNA聚合酶、dNTP、TEMED、β-巯基乙醇等。②PMD-18T克隆载体、限制性内切酶BamH I、Xho I、T4DNA连接酶、DNA marker购自TaKaRa公司。③38份血吸虫病患者血清由安徽省血吸虫病防治研究所惠赠和本室门诊化验收集。

1.3 方法 ①SjP7基因原核表达质粒的构建和鉴定。②SjP7基因的PCR扩增。引物设计根据GenBank登录号为EU121231的日本血吸虫SjP7蛋白核苷酸序列设计并合成引物，引物序列如下：P1：5'-CGCGGATCCATGTCAATATCTGAGTCGTTTG-3'，P2：5' -CCGCTCGAGTTATTCAAGAGAGTCTTCAC-3'。两条引物的5′端分别引入限制性内切酶BamH I、Xho I酶切位点，引物由上海生工生物工程有限公司合成。③重组pET28a(+)Sj P7的表达、纯化和鉴定。④重组pET28a(+)Sj P7的小量诱导表达及鉴定。将-80℃冻存含重组pET28a(+)Sj P7的BL21大肠杆菌，涂布于LB/kana平板，37℃培养过夜。⑤重组pET28a(+)Sj P7的大量诱导表达。⑥大肠杆菌细胞的超声粉碎。⑦重组pET28a(+)SjP7的纯化。⑧重组SjP7应用诊断日本血吸虫病间接ELISA法的建立。间接ELISA的具体步骤：包板：用pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释rSjP7蛋白，每孔100 μl，37℃ 2 h，然后置4℃过夜；封闭：次日弃去包被液，0.1 mmol/L PBS-T(pH 7.4)洗涤酶标反应孔3次，每次5 min，扣干。5%封闭液加满反应孔，4℃封闭过夜；弃封闭液，如上洗涤，每孔加入100 μl用PBS稀释的人血清样品，同时设立空白对照，阳性对照和阴性对照，37℃温育2 h；弃血清样品，如上洗涤，每孔加入100 μl工作浓度的羊抗人IgG-HRP，37℃温育30 min；弃酶标二抗，如上洗涤，每孔加入50 μl TMB显色底物A和B，37℃避光显色10 min，然后每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4终止液终止反应，30 min内于酶标仪测定OD450 值。

1.4 统计学处理 数据录入Excel 2003，采用SPS17.0进行统计分析；各种检测方法间，敏感性、特异性和交叉反应性百分率的比较采用校正卡方检验，以α= 0.05为检验水准，P≤0.05即为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SjP7样基因的PCR扩增和克隆 PCR扩增产物10 μl经1%琼脂糖凝胶电泳后，可见一条近423 bp的特异条带，与预期结果相符合。重组PMD-T-SjP7质粒和重组pET28a-SjP7质粒分别经BamH I和Xho I双酶切后，均可见一条与PCR产物大小一致的DNA片段，以重组pET28a-SjP7为模板进行PCR扩增亦可获得一条与cDNA为模板大小一致的PCR产物。

2.2 SjP7样基因的亚克隆 重组pET28a(+)-SjP7质粒分别经BamH I和Xho I双酶切后，可见一条与PCR产物大小一致的DNA片段，以重组pET28a(+)-SjP7质粒为模板进行PCR扩增亦可获得一条cDNA为模板大小一致的PCR产物(见图1)。

图1 SjP7基因的亚克隆及其PCR扩增

1：DNA 分子量标准；2：重组pET28a(+)-Sj P7载体的双酶切产物；3：重组pET28a(+)-Sj P7质粒的PCR产物。

2.3 重组pET28a(+)-SjP7表达产物的SDS-PAGE的鉴定 重组pET28a(+)-SjP7可在E.coli BL21高效表达6-HIS融合蛋白SjP7，在培养温度为37℃时，融合蛋白少量以可溶形式表达，多数以包涵体形式表达。SDS-PAGE显示其分子量约为20 KDa(见图2)。

图2 pET28a(+)-SjP7在大肠杆菌BL21中的表达

1：低分子量蛋白标准；2-3：pET28a(+)-SjP7诱导前上清与沉淀；4-5：pET28a(+)-SjP7诱导后1 h上清与沉淀；6-7：pET28a(+)-SjP7诱导后3 h上清与沉淀；8-9： pET28a(+)-SjP7诱导后5 h上清与沉淀。

2.4 rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA平行检测样本 用两种方法平行检测34份血吸虫病患者血清、8份钩虫病患者血清和30份正常对照者血清。结果如表1所示。

表1 两种方法检测日本血吸虫病患者及其他人群血清抗体的结果

注：*经校正χ2检验两两间差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA，对于38份血吸虫病患者血清检测的敏感性分别为86.8%和92.1%；26份钩虫病患者血清抗体的阳性率分别为12.5%和25.0%，在40份正常对照者血清中，rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA均出现1例阳性；经校正χ2检验两两间均无显著性差异(P>0.05)。在实验室中初步证明rSjP7-ELISA法诊断血吸虫病与SjAWA-ELISA法有着相似的敏感性、特异性，表明rSjP7蛋白在血吸虫病免疫诊断上具有较大的应用潜能。

目前，国内外多倾向于用基因工程重组抗原进行血清学诊断，以此提高免疫诊断的特异性、敏感性，提高免疫诊断的可重复性，减少诊断试剂的批间差异。

在已有的报道中，罗庆礼等[10]将纯化的26 kDa rSjGST蛋白通过间接ELISA检测急性血吸虫患者血清中特异性抗体，具有很高的特异性，与粪检阳性的符合率为92.3%。谢可鸣等[11]将日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)和重组Sj26(rSj26)抗原分别致敏的硝酸纤维素膜片(NCD)用于膜片免疫酶测定(D-IEA)，平行检测日本血吸虫病人、卫氏并殖吸虫病人、华支睾吸虫病人和健康人血清104例的特异性抗体，结果显示：分别采用上述两种抗原检测所获的阳性率或假阳性率间均无显著性差异(P均>0.05)。此结果均表明以D-IEA检测时显示高度的敏感性(92.1%～94.7%)和特异性(0～2.9%)，表明rSj26抗原的血清诊断效果与SEA抗原相似，具有实用价值。

本实验PCR法扩增出一条大小约为423 bp大小的SjP7样蛋白的DNA片断，将其克隆亚表达质粒pET28a(+)，测序证实具有完整的ORF。氨基酸序列显示其与已知的华支睾吸虫的锌运载蛋白有较高同源性(62%)。

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A preliminary study on the value of P7 protein gene of Schistosoma japonicum immune diagnosis

LIU Xiao-jing1WANG Xue-long2

((1.West Anhui Health Vocational College， Lu'an 237000, China；2. Basic Medical College of Anhui Medical University， Hefei 230032，China)

Objective：To discover new candidate diagnosis molecular for schistosomiasis，the SjP7 protein gene of Schistosoma japonicum were cloned and expressed in E. coli BL21. Indirect ELISA (rSjP7-ELISA) was established for schistosomiasis. Primers were designed and synthesized. Methods：The target gene was amplified from cDNA library by PCR. The product from PCR was cloned into PMD-T vector, and then was subcloned into the expression vector pET28a(+). After induced by IPTG, the cells were collected to analyze by SDS-PAGE and Western blot. Results：For PCR, a specific band of around 423bp was amplified. The gene was subcloned into the expression vector pET28a (+). Conclusion：The rSjP7 has the potential of practical use for the immunodiagnosis of schistosomiasis.

schistosoma japonicum; SjP7 protein; clone; immunodiagnosis

安徽省教育厅2012年度高校省级自然科学研究项目(重点，KJ2013A149)。

刘晓静(1984-)，女，安徽六安人，讲师，硕士研究生，研究方向：病原生物学。

R37

A

1004-7115(2015)03-0241-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.03.001

2014-11-08)