牛蒡子苷纯化工艺优选研究＊

毛 郴 ，付元元 ，刘贵娟 ，赵 语

(1.重庆医科大学附属第一医院药学部，重庆 400016;2.重庆医科大学附属大学城医院药学部，重庆 401331)

牛蒡子 Fructus arctii为菊科牛蒡属植物牛蒡 Arctium lappa L.的干燥成熟果实。现代药理学研究证明，牛蒡子提取物有抗肿瘤、降血糖、抗炎、抗菌、抗流感、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)和抑制血小板聚集等作用[1－4]。牛蒡子苷是牛蒡子的主要有效成分，对于糖尿病及其微血管病变的临床应用前景值得期待[5]。本研究中采用正交试验设计，以牛蒡子苷含量为指标，优选出牛蒡子乙醇回流法的提取条件，再经大孔吸附树脂、硅胶H层析柱纯化精制，得到高纯度的牛蒡子苷。现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱(HPLC)仪(美国Agilent 1100型);RE－5203A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);JY2002型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。牛蒡子苷对照品(中国食品药品检定研究院);牛蒡子药材(重庆桐君阁股份有限公司);AB－8型大孔吸附树脂(净化级)，D101型大孔吸附树脂(净化级)，均为南开大学化工厂产品;HPLC用甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 粗提

通过文献调研[6－8]，确定乙醇回流提取法为适宜的牛蒡子苷提取方法。牛蒡子药材干燥，粉碎，过4号筛，索氏回流提取法，经6倍量石油醚脱脂3次，挥干石油醚，称重，得脱脂粉末;脱脂粉末经8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，旋转蒸发得乙醇提取液的浓缩浸膏。

2.2 含量测定

色谱条件:色谱柱为 Diamonsil TMODS－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇 －水(1 ∶1.1);测定波长 280 nm;流速为0.6 mL/min;进样量为10 μL;柱温:室温。理论塔板数按牛蒡子苷峰计算应不低于1 500。

溶液制备:精密称取牛蒡子苷对照品10.00 mg，加流动相制备成40 g/L的牛蒡子苷对照品溶液。取浓缩浸膏，加流动相溶解后，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液。

含量测定:分别吸取供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件测定，外标法(面积归一法)计算牛蒡子苷的含量。

2.3 醇提法正交试验

因素水平确定:根据预试验情况，选择乙醇体积分数(因素A)、回流次数(因素 B)、提取时间(因素 C)、溶剂用量(因素 D)为考察因素，每个因素选3个水平，以牛蒡子苷含量为考核指标，按 L9(34)正交试验表安排试验。正交试验因素水平见表1。

表1 牛蒡子苷醇提工艺正交试验因素水平

正交试验方法:各称取牛蒡子粗粉10.0 g(过4号筛)，石油醚脱脂后，按表1方法1次提取，每种方法平行制备供试品液2份，4℃冰箱保存备用。按2.2项下方法测定含量，计算极差，结果见表2，方差分析见表3。由表2可知，因素D的极差最小，数据处理时作为最小误差项。由表3可知，各因素对牛蒡子苷醇提工艺影响程度依次为B＞A＞C＞D。

表2 牛蒡子苷醇提工艺正交试验安排表及结果分析

表3 牛蒡子苷醇提工艺正交试验方差分析表

最佳工艺确定:根据直观分析，乙醇体积分数90%，回流3次，回流时间2.5 h，10倍溶剂量为最佳工艺。但为了节省成本和操作方便，选定牛蒡子苷的醇提工艺为:A3B3C2D2，即乙醇体积分数90%，回流次数3次，回流时间2 h，加8倍溶剂量。

2.4 粗分离

吸附原液制备:取牛蒡子粗粉10.0 g，经石油醚脱脂后，70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，浓缩干燥，经10%乙醇充分溶解，定容至100 mL，50摄氏度超声，静置24 h，过滤，备用。原液中牛蒡子苷的质量浓度约为5.08 g/L。

大孔吸附树脂预处理:将大孔吸附树脂(净化级)用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后湿法装柱(300 mm×20 mm)，继而用95%乙醇洗至流出液与水混合不产生浑浊，再用大量蒸馏水洗至无醇味，备用。

上样:将吸附原液缓慢滴加至大孔吸附树脂柱(径高比1∶8)中，吸附流速为1 BV/h。

水洗:原液吸附完成后，用蒸馏水洗，洗脱流速为1 BV/h，洗脱至molish反应呈阴性停止。用量约为1.5倍上样量。

醇洗:选择50%乙醇洗脱，洗脱流速为2 BV/h，用量为4倍上样量。

洗脱液浓缩:收集50%乙醇洗脱液，70℃旋转蒸发，挥干残留洗脱液。

2.5 纯化

硅胶H层析柱纯化牛蒡子苷:湿法装硅胶H层析柱，平衡1 h，吸取柱中多余洗脱剂，缓慢滴加用少量洗脱剂溶解大孔吸附树脂的粗分干燥物，等度洗脱，薄层色谱跟踪，与标准品对照收集单点流分。

重结晶收集牛蒡子苷纯品:45℃旋蒸已收集的单点流分，移取含有剩余少量洗脱剂的悬蒸产物，加入3B量的甲醇－水(1∶1.1)混合溶剂，重结晶，即得牛蒡子苷纯品。HPLC检测结果见图1，牛蒡子苷纯度为98.23%。

图1 HPLC检测牛蒡子苷色谱图

3 讨论

牛蒡子苷多经水或乙醇自牛蒡子干燥药材中提取得到[6－8]。本研究中采用正交试验方法，选择乙醇体积分数、回流次数、提取时间及溶剂用量4个因素进行考察，筛选出最优提取方案，所得粗提物中牛蒡子苷的纯度达90%以上。

大孔吸附树脂是一类人工合成的有机高聚物吸附剂，因其具有多孔性结构而具筛选性，又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性。程顺峰等[9]及孙瑜[10]等利用其对牛蒡子苷进行分离纯化。根据大孔吸附树脂的性质和文献分析，笔者选择常用于木脂素类化合物分离的AB－8型和D101型大孔吸附树脂进行预试验，动态吸附检测发现，D101型后者的流速较慢，且易堵柱，效率较低，故选择AB－8型进行牛蒡子苷的分离研究。本研究中对吸附原液的溶剂浓度进行优化，另外选择纯水作为粗分离时吸附原液的溶剂，除去水不溶物，提高了分离纯度。但由于牛蒡子的醇提物中含有大量的糖类，用水溶解会发生树脂化现象，大大降低牛蒡子苷的收率。

牛蒡子苷的纯化采用硅胶H层析柱、等度洗脱。牛蒡子苷极性较大，通过观察硅胶H层析柱的色带情况，判断开始收集含牛蒡子苷流分的时间，同时薄层色谱跟踪，合并单点流分。本研究中发现，层析柱的径高比、洗脱溶剂的配比选择等对牛蒡子苷的分离纯化效果影响较大，可根据试验具体条件逐一优化。

综上所述，本研究方法制备的牛蒡子苷纯度较高，但收率较低，不适合大量生产和制备，仅适用于对纯度要求较高的实验室或小规模研究。

[1]高 阳，董 雪，康廷国，等.牛蒡苷元体外抗流感病毒活性[J].中草药，2002，33(8):724 －726.

[2]王 潞，赵 烽，刘 珂.牛蒡子苷及牛蒡子苷元的药理作用研究进展[J].中草药，2008，39(3):467 －470.

[3]王丽萍，段晓颖，孙广科.复方牛蒡子含片体外抑菌作用研究[J].中国药业，2010，19(24):15 －16.

[4]郑曦孜，武 彬.牛蒡子防治糖尿病的研究进展[J].中国药业，2010，19(12):82 －83.

[5]付元元，赵 语.牛蒡子苷对糖尿病微血管病变的作用机制研究进展[J].重庆医学，2014，43(21):2 813 －2 815.

[6]卢来春，张 蓉，周世文，等.正交实验优化牛蒡子的提取工艺[J].儿科药学杂志，2007，13(1):10 －11.

[7]王 劲，史 辑，康廷国，等.均匀设计法优化牛蒡子中牛蒡苷的提取工艺[J].中药材，2004，27(2):127 －129.

[8]董文洪，刘 本.超临界流体提取牛蒡子中牛蒡子苷的实验研究[J].中国中药杂志，2006，31(15):1 240 －1 241，1 276.

[9]程顺峰，高 鹏.AB－8大孔树脂分离牛蒡子中木质素类成分研究[J].贵阳中医学院学报，2012，34(4):190－191.

[10]孙 瑜，何 凡，窦德强，等.大孔吸附树脂对牛蒡子中牛蒡苷的纯化工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(7):13－15.